201906. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy fenil-karbamát-származék és savaddíciós sói és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
3 HU 201 906 B 4 A patkány különböző agy területeiről származó acetilkolin-észteráz enzimek gátlása AChE-készítménycket állítottunk elő patkányok különböző agy területeiből (agykéregből, hippocampusból és striatumból), és meghatároztuk az IC50 értékeket (a pM-ban kifejezett gátló koncentrációkat). Az enzimkészítményeket a gátló hatóanyaggal a meghatározás előtt 15 percig előinkubáltuk. Az AChE aktivitást Ell man módszerével mértük [Arch. Biochem. Biophys. 82, 70 (1959)]. Patkányok agyszövetét 7,3 pH értékű, 0,25 mmól koncentrációjú, hideg foszfát-pufferoldatban homogenizáltuk, amely 0,1% Triton X-100-at tartalmazott Centrifugálás után a tiszta felülúszó folyadék alikvot részleteit használtuk enzimforrásként Az enzimet különböző koncentrációkban vett gátlóval előinkubáltuk. Különböző időtartamok eltelte után hozzáadtuk a szubsztrátumot (0,5 mM acetil-tio-kolin-jodidot), és meghatároztuk a megmaradó aktivitást. Eredményeinket az alábbi 1. táblázatban foglaltuk össze. 1. táblázat ICso Agykéreg Hippocampus Striatum "A” vegyület 2,8 3,7 3,0 "B” vegyület 16,1 14,5 13,8 ”C” vegyület 3,2 3,9 3,2 A táblázat adati világosan mutatják, hogy az „A” vegyület AChE-gátló hatása valamivel erősebb, mint a „C” racemáté; a „B” vegyület gátló hatása jelentősen gyengébb. Patkány különböző agyterületeiről származó acetilkolinészteráz gátlása ex vivo kísérletben Az „A” vegyületet különböző dózisokban adagoltuk, és 30 perc elmúltával ex vivo módon meghatároztuk a különböző agyterületekről származó AChE-aktivitást. A fentiekben leírt módszert alkalmaztuk. Azt találtuk, hogy orális adagolás után az IC50-érték 7 pmól/kg a striatumban, 4 pmól/kg a hippocampusban és 2 pmól/kg az agykéregben. A "C” racemát adagolása után kapott ICM-értékek az összes vizsgált agy területeken körülbelül kétszer-háromszor magasabbak. Ha az „A” vegyületet 10 pmól/kg mennyiségben orálisan adagoltuk, akkor az adagolás után 6 órával az AChE-gátlás a striatumban még 16%-osnak adódott; ugyanebben az időpontban e vegyület az enzimaktivitást 44%-ban gátolta a hippocampusban, és 39%-ban gátolta az agykéregben. In vivo vizsgálatok A dopamin-metabolizmusra kifejtett hatás vizsgálata Ezen akut és szubkrónikus kísérleteinkben OFA-törzsű, 150-200 g testtömegű hím patkányokat alkalmaztunk. Az állatokat váltakozva 12 órán át sötétben, majd 12 órán át világosban tartottuk. Az állatokat mindig 11 óra és 13 óra között öltük le. Ezután az állatok agy velejét közvetlenül kimetszettük, jégen feldaraboltuk Glowinski és Iversen módszere szerint [J. Neurochem. 13, 655 (1966)], majd szárazjéghűtéssel lefagyasztottuk, és az elemzés időpontjáig a szövetmintákat-80 °C hőmérsékleten tartottuk. A dopamint és metabolitjait - azaz a DOPAC-ot (3,4-dihidroxi-fenil-ecetsavat) és a HVA-t (homovanillinsavat) - azokban az agyszöveti extraktumokban határoztuk meg, amelyeket úgy kaptunk, hogy a tárolt agyszöveti mintákat 0,05 mM aszkorbinsavat tartalmazó 0,1 n sósavoldatban homogenizáltuk, majd centrifugáltuk. Vizsgálataink céljára a striatumot és az agykérget alkalmaztuk. A metabolitokat vagy gázkromatográfiás-tömegfragmentometriás (GCMS) eljárással [Karoum és munkatársai, J. Neurochem. 25,653 (1975); valamint Catabeni és munkatársai, Science 178,166 (1972)], vagy fluorimetriás módszerrel [Waldmeier és Maitre, AnalyL Biochem. 51, 474 (1973)] határoztuk meg. A GCMS módszer alkalmazása során a szövetkivonatokat úgy állítottuk elő, hogy ismert mennyiségű deuterizált monoamint és a megfelelő metabolitokat adtuk hozzá belső standardokként. Megállapítottuk, hogy a striatumban a dopamin metabolizmusa az „A” vegyület, a „B” vegyület és a „C” racemát adagolását követően fokozódik. (Ez a fokozódás annak a következménye, hogy a fenti anyagok az acetil-kolin felhalmozódását idézik elő.) Megfigyelhető azonban, hogy az „A” vegyület hatásosabb, mint a „B” vagy „C” anyag, mivel az „A” vegyület a dopamin-metabolitok koncentrációját a striatumban jobban megnöveli. Az agyi glükóz felhasználására kifejtett muszkarin- és nikotin-típusú hatások vizsgálata A központi idegrendszer (CNS) működésében előálló változások a dezoxi-glükóz agyi felhasználásának változásaival kapcsolatosak: ez a jelenség egyidőben szemléltethető több agyterületen Sokoloff és munkatársai autoradiográfiás módszerével [J. Neurochem. 28, 897 (1977)]. E vizsgálat során kolinerg hatóanyagok adagolása közvetlenül (muszkarin-agonisták) vagy közvetett úton (az acetil-kolin felhalmozódásának következtében) a különböző agyterületeken végbemenő glükóz-metabolizmust jellemző módon, „ujjlenyomatszerűen” módosítja. E vizsgálataink során Wistar-törzsű, 150-200 g testtömegű hím patkányokat alkalmaztunk. A hatóanyagokat különböző adagokban, különböző utakon (intravénásán, orálisan vagy intraperitoneálisan) adagoltuk. [14C]-2-dezoxi-glükózt 125 pC/kg mennyiségben, az állatok leölése előtt 45 perccel adagoltunk. Ezután azonnal kimetszettük az állatok agyvelejét, -80 'C hőmérsékleten lefagyasztottuk, és utána 20 pm vastagságú szeletekre vágtuk. A radigráfiás képfelvételeken az optikai sűrűség értékeit Sokoloff és munkatársai módszerének módosításával határoztuk meg. Az „A” és „B” vegyületek 7,5 pmól/kg mennyiségben történő orális adagolása után a dezoxi-glükóz felhasználásában, patkányok különböző agyterületein jelentős változásokat figyeltünk meg. Az első 30 percben az „A” vegyület hatásosabb, mint a „B” vegyület. A legjelentősebb változásokat a látható területeken, valamint a thalamus elülső részén és a habenula (nyelecske) oldalsó magvában figyeltük meg. Az acetil-kolin koncentrációjának vizsgálata patkány különböző agyterületein Az „A” és „B” vegyületek, valamint a „C” racemát in vivo kifejtett AChE-gátló hatását úgy állapítottuk meg, hogy megmértük az ACh koncentrációját patká5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
