201844. lajstromszámú szabadalom • Immunadszorpciós-amidolitikus módszer a humán vizelet-plazminogén aktivátor prekurzor ( pro-uPA) és a humán vizelet -plazminogén aktivátor (u-PA) meghatározására
HU 201844 B gatnyi hideg desztillált vízzel mossuk át, 20 percen belül. A gélt ezután reszuszpendáljuk pH= 8-as, 0,1 M nátrium-bikarbonát pufferben (végső térfogat = 20 ml). Erősen tisztított, a fentiek szerint előállított, 0,1 M, pH= 8-as nátrium-bikarbonát pufferben oldott (9,7 ml) 5B4-es monoklonális antitestet adunk hozzá a gél szuszpenzióhoz. 4 óra múlva szobahőmérsékleten 1M vizes etanolaminhidrokloridot (1^5 ml) adunk hozzá pH = 8-on, a gyanta nem-reagált észtercsoportjainak blokkolása céljából. A blokkoló reakció szobahőmérsékleten egy órán belül teljesen végbemegy. A gélt ezután oszlopra visszük fel, a kötő puffer (pH = 8-as 0,1 M vizes nátrium-bikarbonát) 10-szeres térfogatával mossuk, majd 0,1 M vizes ecetsavval, ezt követően pedig 1M vizes nátrium-kloridot tartalmazó 0,1 M vizes ecetsavval, s végül 0,5 M vizes nátrium-ldoridot tartalmazó pH = 7-es 0,05 M-os vizes nátriumfoszfát pufferrel. A kötés hatékonyságát a felülúszó mintákban spektrofotometriás módszerrel vizsgáljuk 280 nm-en, a reakció előtt és után. E mintákat a vizsgálat előtt pH = 2-re állítottuk be, hogy kiküszöböljük az N-hidroxi-szukcinimid interferenciát a leolvasások során. A gyanta 1 ml-ére vonatkoztatva 2,5-4 mg 5KB4- es monoklonális antitestet immobilizáltunk. 5. készítmény a) Az 5B4-Agaróz adszorbens kapacitásának megállapítása Az 5B4-agaróz maximális kapacitását „tiszta” és tisztítatlan u-PA készítményeken állapítottuk meg. 5B4-agaróz oszlopot (1,6x10 cm) ekvilibráljuk 0,5 M NaCl-ot tartalmazó 0,05 MpH= 7-es nátrium-foszfát pufferben, majd „tiszta” u-PA-t (120.000 NE/mg) viszünk fel rá, míg az észterolitikus aktivitás észlelhetővé nem válik a kifolyó anyagban. Az oszlopot ezután az ekvilibráló pufferrel mossuk, és az enzimet deszorbeáljuk azáltal, hogy 1 M NaCl-os 0,1 M ecetsavval eluáljuk. A kötött frakcióban visszanyert összaktivitást tekintjük az oszlop maximális kapacitásának. Az u-PA esetében (120.000 NE/mg) az 5B4-agaróz kapacitása 216.000 NE/ml. Ugyanezen kísérleteket megismételtük tisztítatlan u-PA készítmény (700 NE/mg) felhasználásával, s ekkor 174.000 NE/ml-es kapacitást nyertünk. b) A pro-uPA, nagy molekulatőmegfi -u-PA, kis molekulatömegé -u-PA és a 18000-es u-PA aminoterminálisfragmens immunadszorpciója 5B4-agarózon Tisztított nagy molekulatömegű u-PA-t inkubálünk 8 órán keresztül 0,2 M NaCl-ot tartalmazó 15 1 ml 50 mM-os, pH = 8-as nátrium-foszfát pufferben. Nagy molekulatömegű u-PA-t, kis molekulatömegű u-PA-t és 18000-es proteolitikus fragmenst 4:4:2 arányban nyerünk. E termékeket gélszűrés segítségével választjuk szét és izoláljuk keresztkötésű, ellenőrzött pórusú poli-dextránon (Sephadex* G 100, szuper-minőségű; 1,5x100 cm); ezt 0,2 M NaCl-ot tartalmazó 5 mM pH = 4-es nátrium-foszfát pufferrel ekvilibráljuk, és 3 ml/óra áramlási sebességgel ugyanazon keverékkel eluáljuk. Ezt követően összegyűjtjük az egyetlen terméket tartalmazó eluált frakciókat. 0,1 tf% TweenR 20-at tartalmazó pH= 7,5-ös foszfát-pufferes sóoldatban lévő (a fent leírtak szerint készített) 5B4-agaróz skaláris mennyiségeinek szuszpenzióit adjuk hozzá 0,5 ml ugyanazon pufferben oldott pro-uPA nagy molekulatömegű-u-PA, kis molekulatömegfi-u- PA, illetve 18000-es amino-terminális fragmens u- PA-oldatokat — valamennyit 250 pg/ml mennyiségben — tartalmazó kémcsövekhez, és a végső térfogatot ugyanezen pufferrel 1,5 ml-re egészítjük ki. Valamennyi mintát forgatjuk szobahőmérsékleten 1 órán keresztül, majd 2000 rpm-en 5 percig centrifugáljuk. A nem-kötött anyagot úgy határozzuk meg, hogy a felülúszók optikai sűrűségét 280 nm-en leolvassuk, a kötött anyagot pedig a hozzáadott összes anyagtól való különbsége alapján határozzuk meg. Ezen kísérletekben a pro-uPA, a nagy molekulatömegű u-PA és a 18000-es amino-terminális fragmensnek több mint 90%-a kerül immunadszorpció révén az 5B4-agarózra, míg a kis molekulatömegű-u-PA nem immunadszorbeálódik. 6. készítmény Az u-PA tisztítása 5B4-agarózon mért immunaffinitás segítségével Egy kromatográfiás oszlopot (1,6x9 cm) a 2. példa szerint készített 5B4-agaróz immunadszorbenssel töltünk meg és 0,5 M vizes nátrium-kloriddal és 0,05 M pH- 7-es vizes foszfát pufferrel ekvilibráljuk. Ezután a tisztítatlan vizelet koncentrátumot 60 ml óránkénti áramlási sebességgel felvisszük az oszlopra. Az ekvilibráló pufferrel végzett átmosás után az u-PA-t 1M vizes nátrium-kloriddal és 0,1 M vizes ecetsavval eluáljuk. Az u-PA-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, semlegesítjük és mélyhűtéssel szárítjuk. A visszanyert u-PA specifikus aktivitása mindig nagyobb 130.000 NE/mg-nél A mennyiségi adatokat a következő táblázat tartalmazza: 16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 9
