201844. lajstromszámú szabadalom • Immunadszorpciós-amidolitikus módszer a humán vizelet-plazminogén aktivátor prekurzor ( pro-uPA) és a humán vizelet -plazminogén aktivátor (u-PA) meghatározására
HU 201844 B 17 IV. táblázat 18 Frakció Térfogat ml Teljes fibrinolitikus aktivitás8' NE % Teljes Összfehéije észterolitikus mg aktivitás") aktivitás EE Specifikus aktivitás NE/mg Tisztítási faktor NE/EE Tisztítatlan kivonat 186 1772394 100 897 2007 883-Nem-kötött frakció (A) 270 141791 8 164 _-846 Kötött frakció (B) 56 1374240 77,5 683 9,52 144353 163 2012 a) meghatározva lényegében az 1979-es Addendum of the British Pharmacopoea-ban leírt módszer szerint b) meghatározva lényegében a Sherry és munkatársai által leírt módszer (J. Lab. Clin. Med., 64,145,1964) szerint, ALME-n V. táblázat Tromboplasztinos szennyeződések: Akut toxicitás egérben: Szisztémás tolerálhatóság kutyában: 0-alvadás 193 NE/ml-es plazmaértéknél (a National Heart and Lung Institute, USA, szerint a O-alvadás értéke: 80 NE/ml plazma) 100.000 NE/kg i.v. dózisban nem toxikus 20.000 NE/kg dózis esetén nem volt szignifikáns változás az artériás vérnyomásban A HPLC analízis során nagy molekulatömegű (54000-es) u-PA jelenléte és kis molekulatömegű (330000-es) u-PA hiánya volt megfigyelhető. A kapott u-PA tisztaságát nátrium-dodecil-szulfát-poliakril-amidon végzett gél-elektroforézissel 40 is bizonyítottuk. Valóban, ez a vizsgálat is megerősíti, hogy az 5B4-agarózon tisztított u-PA termék lényegében 54000-es molekulatömegű u-PA. A kísérleteket néhányszor megismételtük — több mint 50 alkalommal — anélkül, hogy az ered- 45 mények szignifikánsan változtak volna. Az oszlopra felvitt fibrinolitikus aktivitás 70- 80%-a következetesen kimutatható a kötött frakciókban. Amikor a nem-kötött frakciókat újra felvisszük az oszlopra, az egész aktivitás kimutatható 50 az átáramló folyadékban, ami arra utal, hogy ezen aktivitás nem az u-PA-nak, hanem inkább az u-PA- tól független fibrinolitikus aktivitással rendelkező aspecifikus proteázoknak tulajdonítható. 55 7. készítmény A pro-uPA tisztítása Az 1. készítménynél leírtak szerint előállított 5B4-es oszlopot (1,6x10 cm) 0,1%-os Triton X- 100-at (Rohm and Hass) tartalmazó 0,15 M NC1- 60 dal és 0,5 M pH = 7-es nátrium-foszfát pufferrel ekvilibráltuk. Az oszlopra 101 A431-es sejt-felülúszót (3. készítmény) visszünk fel 200 ml óránkénti sebességgel, 4 °C-on, majd az ekvilibráló pufferrel átmossuk. A deszorpciót 0,1%-os Triton X-100-at 65 tartalmazó 1M NaCl-dal és 0,1 M ecetsavval végzett eluálással hajtjuk végre. A frakciókat összegyűjtjük és S2444-es szubsztráton vizsgáljuk amidolitikus assay segítségével, plazminnal végzett aktiválás előtt és után, a fent leírtak szerint. A pro-uPA- t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. Az összegyűjtött oldatot tovább tisztítjuk, és FPLC-n (Pharmacia, Svédország) végzett ioncserélő kromatográfia segítségével koncentráljuk, 50 mM pH = 4,0-es nátrium-acetát pufferrel (”A” puffer) ekvilibrált Mono S HR5/5-ÖS kationcserélő oszlop (5x50 cm) alkalmazásával. A mintát kétszeresre hígítjuk desztillált vízzel, és felvisszük az oszlopra. Az ekvilibráló pufferrel végzett mosás után a kötött pro-uPA-t eluáljuk só/pH gradienssel (0,3 M ,A” pufferben oldott NaCl-tól — pH = 4,0-en — 0,7 M „A” pufferben oldott NaCl-ig — pH= 0,5-ig — lineáris gradiens 50 percen belül, áramlási sebesség: 60 ml/óra, végül 1 M NaCl-ot tartalmazó, pH = 5,0-ös ,A” pufferrel). Az eluált frakciókat a fent leírt S2444-en végzett amidolitikus vizsgálat segítségével ellenőrizzük, és a pro-uPA-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és fagyasztva tároljuk. A kapott termék (pro-uPA) homogénnek tűnik SDS-PAGE során. Az SDS-PAGE, a Western-blot vizsgált és a zimográfia azt mutatja, hogy a fentiek szerint tisztított pro-uPA egy körülbelül 48000-es molekulatömegű, egyetlen láncú fehérje, mely immunológiailag a vizelet-típusú PA-val rokon és különbözik a 10
