201844. lajstromszámú szabadalom • Immunadszorpciós-amidolitikus módszer a humán vizelet-plazminogén aktivátor prekurzor ( pro-uPA) és a humán vizelet -plazminogén aktivátor (u-PA) meghatározására

HU 201844 B

13

14

200 |xl 1 mg/ml-es—0,1 m pH = 5-ös citrát-pufferben és 1,7 mM H202-ben oldott — o-fenilén-diamin (SIGMA) kromogénoldattal inkubáljuk. A szín előhívása 20 percen belül megtörténik. Ezután 492 nm-en leolvassuk az optikai sűrűséget vakpróbával szemben, antigén és antitest nélkül. Azon vájatokat tekintjük pozitívnak, amelyekben a szin intenzitása 4-szer magasabb a vakpróbánál.

fotoretriás módszerrel határoztuk meg 280 nm-en (E1%i cm = 14), míg a kötött antitest koncentrációt a hozzáadott antitest összmennyiségétől való különbség alapján számítjuk ki. Az összes kötési ada- 5 tot Scatchard módszere (Ann. N. Y. Acad. Sd., 51, 660-672, /1949/) szerint dolgozzuk fel. Az 5B4 elnevezésű monoklonális antitest affinitási állandója 1,42 x 10 71/mól.

q) Anti-u-PA-t termelő hibridomúk klónozása Anti-u-PA antitestet termelő hibridomákat kiválogatjuk, meghatározott hígítással klónozzuk, tömegkultúrában tenyésztjük, és előzetesen 0,5 ml PRISTAN -rel(2,6,10,14-tetra-metil-pena-dekán, Aldrich) kezelt Balb/c egerek peritoneumába injiciáljuk. 15 nappal később összegyűjtjük az aszdtesfolyadékot. Az anti-u-PA monoklonális antitestek koncentrádója a 10-20 mg/ml-es tartományba esik. Protein-A Sepharose vagy urokináz-Sepharose affinitásos kromatográfia segítségével tisztítjuk őket.

d) Az anti-u-PA monoklonális antitestek tisztítása SepharoseR-u-PA-n végzett aífinitásos kromatográfiával

CNBr-dal aktivált nagy molekulatömegű Sepharose és erősen tisztított u-PA (120.000 NE/mg) reagáltatásával Sepharose-u-PA konjugátumot készítünk. A kapcsolódás hatékonysága körülbelül 20 mg u-PA, a duzzasztott gél 1 ml-ére számítva. A fentiek szerint nyert aszcites folyadékot—termelő hibridománként 1 ml-t — viszünk fel a Sepharoseurokináz aífinitásos oszlopra (1,6 cm x 15 cm), melyet pH = 8,0-as, 0,01 M nátrium-foszfát pufferben előzetesen ekvilibráltunk. Ugyanazon pufferrel végzett átöblítést követően a szelektíven adszorbeált anti-urokináz monoklonális antitesteket pH= 3,0-as, 0,1 M ecetsavval eluáljuk. Az ellenanyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és PSDE 09005-ös Millipore membránon végzett ultrafiltrálás segítségével koncentráljuk, majd felhasználásig fagyasztva tároljuk.

e) A monoklonális antitest készítmények tisztaságának és homogenitásának ellenőrzése gél-elektroforézissel

A fentiek szerint nyert monoklonális antitesttel SDS-PAGE-t (nátrium-dodecil-foszfát poli-akrilamid-gél-elektroforézist) végeztünk, a W.KLaemmli által leírt módszer szerint (Nature 227,680, 1970). Csak a nehéz és könnyű IgG láncoknak megfelelő csíkok látszanak, ami arra utal, hogy a fenti eluátum tiszta immunglobulinokat tartalmaz.

f) Az affinitási állandó meghatározása PH = 7-es foszfát-pufferes sóoldatban szuszpendált 20%-os Sepharose-u-PA azonos mennyiségeit (valamennyi 0,5 ml) adjuk hozzá tisztított anti-u-PA monoklonális antitest készítmények növekvő koncentrádóihoz (e készítmények azonosak a fenti d) pont szerint előállítottakkal, pH= 7-es foszfát-pufferes sóoldatban dializálva. A mintákat két órán keresztül szobahőmérsékleten „vég a vég felett” forgatjuk. A kontrollokhoz nem adtunk gyantát.

A nem-kötött antitest koncentrációját spektro-10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2. készítmény

Az anti-u-PA immunglobulin (IgG-k) megtisztítása anti-urokináz hagyományos antiszérumtól

Anti-urokináz nyúl antiszérumot állítottunk elő a szokásos immunizációs eljárások szerint, erősen tisztított 54000-es molekulatömegű u-PA felhasználásával (körülbelül 120.000 NE/mg).

Részletesebben, egészséges fehér, New Zealand nyulakat immunizálunk 500 pg, komplett Freundadjuvánsban lévő, erősen tisztított 54000-es molekulatömegű u-PA-val (körülbelül 120.000 NE/mg). Az antigén azonos mennyiségét — inkomplett Freund-adjuvánsban — adjuk be, hirtelen lökésszerű injekciók formájában, 4, 6 és 8 hét elteltével. Az állatoktól hetente vért veszünk, és az anti-u-PA antitest titereket anti-u-PA antiszérum enzim — immunassay segítségével határozzuk meg. 12 hét után az állatokat teljesen elvéreztetjük, és az IgG immunglobulin frakciót aífinitásos kromatográfiával tisztítjuk, protein-A Sepharose-on. A kapott antiszérum 1 ml-ét protein-A Sepharose oszlopra visszük fel (oszlopméret 1,6 cm x 4 cm), melyet előzetesen 0,1 M pH = 8-as nátrium-foszfát pufferrel, 20 ml/órás áramlási sebességnél ekvilibráltunk. Ugyanazon pufferrel végzett mosás után az IgG-ket PH = 3-as 0,1 M ecetsavval eluáljuk. 2 ml-es frakciókat gyűjtünk és az IgG-k jelenlétét enzim-immunassay segítségével ellenőrizzük. Az IgG-ket tartalmazó frakciókat pH = 7,2-re állítjuk be, és felhasználásig -20 °C-on fagyasztva tároljuk.

3. készítmény

A431-es sejt-felülúszó előállítása A431-es humán epidermoid karcinoma sejteket tenyésztünk, előnyösen Fabrian és munkatársainak módszere (Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 74, 565, 1977) szerint. Pontosabban, az A431-es sejteket 10% fötális borjúszérumot (Flow Laboratories), 100 E/pl penicillint, 100 pg/ml streptomycint (Flow Laboratories) és 2 M glutamint (Flow Laboratories) tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagletáptalajon tenyésztjük egybeolvadásig, műanyag tenyésztőedényekben, 150 cm-es tenyésztési felületen (NUNC). Ezután a felülúszókat összegyűjtjük, centrifugáljuk a törmelék eltávolítása céljából, és -80 °C-on tároljuk proteáz inhibitor (aprotinin, 10 g/ml) jelenlétében, a felhasználásig.

4. készítmény

5B4-es anti-u-PA monoklonális antitest immobilizálása aktivált agarózon

Aktivált agarózt (kereszt-kötésű, 10 atom hosszúságú összekötő karokkal kapcsolt agaróz szemcsék N-hidroxi-szukcinimid aktív észter-származéka; Affi-gél 10 , Bio-rad Inc., 14 g, nedves) 3-szoros térfogatú izopropil-alkoholla] és 3 térfo-8