201844. lajstromszámú szabadalom • Immunadszorpciós-amidolitikus módszer a humán vizelet-plazminogén aktivátor prekurzor ( pro-uPA) és a humán vizelet -plazminogén aktivátor (u-PA) meghatározására
HU 201844 B 11 12 Ilb) táblázat folytatása A 431-es sejt-felülúszóhoz hozzáadott u-PA és pro-uPA analitikai visszanyerése ”A” minta Hozzáadott u-PA (NE/ml) Visszanyerés (%) ”B” minta Hozzáadott pro-uPA A(NE/ml) Visszanyerés (%) 5,8 89,9 2,3 102,2 2,9 93,0 —Átlag 95,2 Átlag 96,9 A kezdeti u-PA koncentráció nem volt mérhető sem az „A”, sem a „B” mintában; a pro-uPA kezdeti koncentrációja 42,56 NE/ml volt az „A” mintában, a „B” mintában pedig 5,32 NE/ml. III. táblázat u-PA és pro-uPA koncentrációk a 431-es sejt-felülúszókban, különböző hígítások esetén u-PA, NE/ml pro-uPA, NE/ml V/T )%) Hígítási arány Várt Talált T/V (%) Várt Talált 1,5 31,89 30,57 95,2 53,36 56,03 105 2,25 31,89 31,89 100,0 53,36 56,19 105,3 3,375 31,89 34,1 107,1 53,36 40,03 91,9 5,0625 31,89 33,78 105,9 53,36 58,1 108,8 A fenti kísérletek megismétlése esetén—vizelet vagy u-PA-t és/vagy pro-uPA-t tartalmazó fermentációs bakteriológiai táptalaj felhasználásával — lényegében azonos pontosságú, megbízhatóságú és érzékenységű eredményeket kaptunk. 35 Pontosabban, a validitási kísérletek azt mutatják, hogy a vizsgálaton belüli pontosság (VK%) 3-7% között, a vizsgálatok közötti pontosság (VK%) pedig általában 5-10% között változik. Az analitikai visszanyerés 90-110%. 40 A vizsgált anyag alkalmazási tartománya 15 mg/ml és 100 mg/ml közé esik. 1. készítmény 5B4-es anti-u-PA monoklonális antitest előállí- 45 tása a) Anti-u-PA monoklonális antitestek előállítása Erősen tisztított 54000 dalton molekulatömegű 120.000 NE/mg aktivitású u-PA-val (PERSOLV* RICHTER) immunizálunk 7 hetes nőstény Balb/c 50 egereket. Ezen u-PA komplett Freund-adjuvánsban oldott 10 jxg-ját injiciáljuk az állatok peritoneurnába, 60 nappal a fúzió előtt. 30 nappal később újabb 10 pg-t adunk be az egereknek. A fúzió előtt 10 nappal hagyományos ELISA módszerrel mérjük 55 az anti-u-PA antitest-titert, a farokvénából vett vérmintákban, és 5 nappal az egyesítés előtt egy utolsó 10 jig-os, hirtelen, lökésszerű u-PA injekciót adunk be intravénásán azon állatoknak, melyek antitest titere 1:10000-nél magasabb. Ezután a fúzió napján 60 kivesszük xz. állatok lépét, és a lépsejteket (körülbelül lxlO8) 50%-os PEG 6000-ben levő, 5xl07 X63-Ag8653-as egér mieloma sejtekkel egyesítjük. A lényegében C.Milstein és G. Köhler módszere szerint végzett fúzió után a sejteket 10%-os fötális 65 boíjúszérummal és HAT táptalajjal (0,1 mM hipoxantin, 0,25 mM aminopterin, 0,017 mM timidin, Flow Laboratories) kiegészített, Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajban reszuszpendáljuk, és 5 különböző — egér makofágokat tartalmazó — Costar lemezre (adagoló réteg) helyezzük őket. A HAT táptalajt 3 naponként cseréljük, és a fúziót követő 10. nap után a felülúszóhat 2-3 naponként ELISA immunassay segítségével vizsgáljuk, anti-u-PA monoklonális antitestek jelenléte szempontjából. b) Anti-u-PA monoklonális antitestet termelő hibridomák szűrése EUSA módszerrel A Perlman-módszer (Immunochemistry, 8,873 /197V) módosítása szerint rugalmas, 96 vájatos mikrotiteres lemezeket (Dynatech), vájatonként 50 pl pH = 7,2-es foszfát-pufferes sóoldatban és 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó, pH= 7-es 0,05 M-os nátrium-foszfátban oldott, 20 pg/ml-es u-PA-val vonjuk be, és 1 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. 0,05%-os Tween 20-as foszfát pufferes sóoldattal végzett alapos mosás után a vájatokat 3%-os bovin szérum albumin foszfát-pufferes sóoldattal telítjük 3 órán keresztül, szobahőmérsékleten, a nem-specifikus kötés elkerülése érdekében. Gondos mosás után 50 pl felülúszó hibridoma tenyészetet (vagy aszdtes-folyadék azonos mennyiségét) adjuk hozzá a vájatokhoz, és 2 órán keresztül, szobahőmérsékleten reagáltatjuk őket egymással. A lemezeket ezután mossuk és 1:1000 hígítású torma-peroxidázzal (PI61, DAKO) konjugált, egér ellen termelt nyúl Ig-nal szobahőmérsékleten, 90 percen keresztül inkubáljuk. Alapos mosást követően a lemezeket vájatonként 7
