201844. lajstromszámú szabadalom • Immunadszorpciós-amidolitikus módszer a humán vizelet-plazminogén aktivátor prekurzor ( pro-uPA) és a humán vizelet -plazminogén aktivátor (u-PA) meghatározására
HU 201844 B Az a tény, hogy interakció nem áll fenn a nagy molekulasúlyú u-PA-nak ß-merkapto-etanollal történő redukálásakor, azt jelzi, hogy a redukálószer okozta szerkezeti változások tönkreteszik az epitópot. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott 86/01411. sz. PCT. szerinti közzétételi iratban leírt monoklonális antitestet a „nem-szekretáló” típusú egér mieloma sejtek — azaz olyan mieloma sejtek, melyek nem szekretálnak immunglobulinokat—és az előzetesen u-PA-val immunizált egér lépsejtek szomatikus sejtfúziójával nyeljük. Röviden, Balb/c egereket immunizálunk erősen tisztított, 54000-es molekulatömegű u-PA-val, majd az eltávolított lépsejteket olyan nem-szekretáló mieloma sejtekkel egyesítjük, melyek bizonyos genetikus defektusokban szenvednek. E genetikus defektusok képtelenné teszik a sejteket arra, hogy egy bizonyos táptalajon túlélést mutassanak, ami igen hasznos a hibrid-sejtek ezt követő izolálása szempontjából. Példaként említhetjük az ilyen sejtvonalakra az X63-Ag8653-as sejtvonalat, amelyet Kearney és munkatársai írtak le (J. Immunoi. 123, 1548-1550 /1979/), és amely a szakemberek számára ismert és elérhető. Az ilyen mielma-sejtvonalak általában számos tudományos intézményen keresztül beszerezhetők, például a következő helyekről: The Salk Institute, Cell Distribution Center, P.O. Box 1809, San Diego, California 92112 és Institute for Medical Research, NIGMS Cell Repository, Copewood and Davis Streets, Camden, New Jersey 08103. A sejtek egyesítését poli-etilén-glikol, előnyösen poli-etilénglikol(PEG) 6000 jelenlétében végezzük. Erősen tisztított 54000-es u-PA (nagy molekulatömegű u-PA) számos kereskedelmi forrásból beszerezhető. Előnyösen az erősen tisztított u-PA készítmény titere nemzetközi egységekben kifejezve (NE), valamint a fibrinolitikus/ észterolitikus aktivitás aránya magas, a tromboplasztinos szennyeződés pedig igen kis mennyiségű vagy gyakorlatilag hiányzik. Előnyös, erősen tisztított u-PA a PERSOLVr (Gruppo Lepetit S.pA.) márkanéven forgalmazott készítmény, melynek fibrinolitikus aktivitása 100.000 NE/mg-nál magasabb, a fibrinolitikus/észterolitikus aktivitás aránya 1,4-nél nagyobb, nyulakban 20000 NE/kg-nál magasabb dózisokban is pirogénmentes és 200 NE/ml-es plazma-koncentrációnál nincs koaguláns aktivitása. Az immunizádós sémában előnyösen kis dózisú u-PA adása szerepel. Az egyik jellegzetes immunizációs séma szerint először kis dózisú, erősen tisztított 54000-es molekulatömegű u-PA (120.000 NE/mg; körülbelül 10 jig) adunk egereknek i.p., komplett Freund-adjuvánsban, 60 nappal az egyesítés előtt, majd egy második i.p. injekrió során ugyanazon mennyiséget inkomplett Freundadjuvánsban, 30 nappal az egyesítés előtt, végül ugyanazon mennyiséget adjuk be 5 nappal az egyesítés előtt, hirtelen, lökésszerű i.v. injekrió formájában. Csak azon állatoknak adjuk be ezt a végső, lökésszerű injekciót és csak azok kerülnek további feldolgozásra, amelyeknek az egyesítés előtt 10 nappal magasabb az anti-u-PA antitest literük 5 l:10.000-nél. A lépeket eltávolítottak, és a lépsejteket körülbelül 108 az 5x10' sejthez arányban egyesítjük a mieloma sejtekkel. A fúzió után a sejteket megfelelő táptalajon, például 10% fötális borjúszérumot tartalmazó, Dulbeco-féle módosított Eagle-táptalajon tenyésztjük, és az egyesített sejteket hipoxantin, aminopterin, timidin (HAT) táptalajon szelektáljuk. A sejttenyészetek felülúszóit ELISA módszerrel, azaz peroxidázzal jelzett, egér ellen termelt immunglobulinos „hagyományos” antiszérummal vizsgáljuk, anti-u-PA antitestek szempontjából. Az így azonosított anti-u-PA monoklonális antitestek tisztítása ioncserélő kromatográfia vagy affinitásos kromatográfia segítségével végezhető, urokinázagaróz oszlopon, míg a kapott termék homogenitásának megállapítására a gél-elektroforézis az alkalmas eszköz. Ezen anti-u-PA monoklonális antitest készítményeket ezután osztály-specifitás és az agarózon immobilizált antigénre vonatkozó affinitási állandó szempontjából értékeljük. Az osztály-specifitást az Outcherlony-féle kettős immundiffúziós technikával vizsgáljuk (Acta Pathol. Microbiol. Scand. 26, 507 /1949/); az affinitási állandót pedig előnyösen Tsapis és munkatársai módszere szerint végzett egyensúlyi kötési kísérletek segítségével határozzuk meg (Tsapis A., Rogard N., Alisén A., and Nihaesco C. Eur J. Biochem. 64,369 /1976/). Ezen kísérletekben lényegében tiszta, előzetesen foszfáttal pH=7,2-re pufferolt sóoldatban dializált monoklonális antitestek növekvő koncentrációit adtuk hozzá az urokinázt hordozó, azaz például u-PA- agaróz mátrixhoz. A nem kötött antitest koncentrációját spektrofotometria segítségével határoztuk meg, a kötött antitest koncentrációt pedig az összes hozzáadott antitesttől való különbség alapján számítottuk ki. A kötési adatokat az ismert statisztikai módszerek, azaz a G.Scatchard által leírt (Ann. N. Y. Acad. 51,660-672/1949/) eljárás szerint értékeltük. Az analitikai segédanyagoknak a monoklonális antitesttel vagy a hagyományos antiszérummal való bevonása úgy történik, hogy kapcsolatba hozzuk az antiszérum antitest hígításának oldatával, amelyben az antitest mennyisége sokkal nagyobb a meghatározandó antigén mennyiségénél. Az esetleg be nem vont felszint oly módon telítjük, hogy nem-interferáló fehérjeoldatot — például bovin szérum albumint — adunk hozzá, feleslegben. Bevonás után az analitikai segédanyagot rázással szárítjuk, és körülbelül 4 °C-on tároljuk a felhasználásig. Előnyös analitikai segédanyag a poli-vinil-klorid mikrolemez, például a Falcon Microtest III típusú rugalmas vizsgálati lemez (Bevton-Dickson, USA), amelyen minden egyes vájat 0,5 ^g/ml-50 jig/ml 5B4-es monoklonális antitest oldattal érintkezik. Az „enzimatikus aktivátor” azon ismert anyagok egyike, melyek képesek a pro-uPA-nak (egyetlen láncú, enzimatikusan inaktív zimogén) u-PA-vá (kettős láncú aktív enzimmé) történő átalakítására. A pro-uPA említett enzimatikus aktivátoraira példák a tripszin-szerű endopeptidek, mint például a plazmin, a tripszin, a trombin és a kallikrein. Ezek közül a plazmin az előnyös aktivátor, mely 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
