201844. lajstromszámú szabadalom • Immunadszorpciós-amidolitikus módszer a humán vizelet-plazminogén aktivátor prekurzor ( pro-uPA) és a humán vizelet -plazminogén aktivátor (u-PA) meghatározására
HU 201844 B szelektíven hasítja fel a peptidláncot a 158-as helyzetben lévő lián (Lys) csoport környezetében (1. kasai et al., J. Bioi. Chem., 22,12383-12389 /1985/). Ez az enzimatikus aktiválás a pro-uPA-t olyan aktivált formává alakítja át, melynek enzimatikus aktivitása nagyon hasonló az u-PA-hoz, és legalábbis a plazmin aktiválás esetében, alapos bizonyíték van arra, hogy ez az enzimatikusan aktív termék valóban az u-PA. Az u-PA-ra vonatkozó „amidolitikus vizsgálatok” ismertek a szakterületen. A találmány szerinti eljárás szempontjából a kromogén szubsztrátok „hidrolízisén” alapuló amidolitikus vizsgálatok az előnyösek. Sok különböző, ilyen típusú u-PA szubsztrát ismert a szakterületen és szerezhető be a kereskedelmi forgalomban. Ezen eljárás során az egyik előnyös szubsztrát egy szintetikus oligopeptid származék, a piro-glutamil-glicil-arginil-p-nitro-anilid (piro-Glu-Gly-Arg-pNA), melyet a Kabi cég (Svédország) S2444 jelzéssel hoz forgalomba. Az u-PA és/vagy a pro-uPA „standard” készítményei is ismertek, és olyan tisztítási eljárással is előállíthatók, melynek során afíinitásos segédanyagon immobilizált 5B4-es monoklonális antitestet alkalmaznak. A validitási kísérletek azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárás vizsgálaton belüli pontossága (VK% = variációs koefficiens) 3-7% között változik, míg a vizsgálatok közötti pontosság (VK%) általában 5-10% között van. Az analitikai visszanyerés 90-110% között változik. Az alkalmazási tartomány 1-100 NE/ml u-PA, előnyösen 1,5-55 NE/ml. A pro-uPA koncentrációját az enzimatikus aktiváció után mért, megfelelő, ekvivalens u-PA nemzetközi egységekben (NE)/ml-ben fejezzük ki. A találmányt az alábbi példákkal és a találmány szerinti készítmények leírásával szemléltetjük. 1. példa Immunadszorpciós amidolitikus vizsgálat Mind u-PA-t, mind pedig pro-uPA-t tartalmazó A431-es sejtfeliílúszókat (lásd a 3. készítmény) kétszeresre hatottunk 60 g/1 bovin szérum albumint (BSA), valamint 0,1%-os Tween 20-at — poli-oxietilén-szorbitán-mono-laurátot — tartalmazó, 0,3 M nátrium-klorid és pH = 73-as 0,1 m nátriumfoszfát puffer oldatával. A referencia standardot (nagy molekulatömegű u-PA) különböző koncentrációkra hígítottuk (525, 26,25,13,12,6,562,3,281 NE/ml), 0,15 M nátrium-klorid és 0,05 M pH = 7,3-as nátrium-foszfát puffer (PBS= phosphate 7 buffer solution) oldatában, mely 0,05% Tween 20- at, 30 g/1 BSA-t és 50% Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajt (DMEM= Dulbeco’s Modified Eagle Medium) Flow Laboratories, USA) tartal- 5 máz. Valamennyi standard és minta azonos mennyiségeit (200 jjJ-t) helyezzük triplikátumban a 8. készítményénél leírtak szerint 5B4-gyel bevont mikrolemez különböző vájataihoz. Az oldatok érintkezését két órán keresztül szobahőmérsékle- 10 ten, nedves, fedett dobozban biztosítjuk. Ezután a lemezt 8-szor átmossuk oly módon, hogy kiürítés után megtöltjük 0,05% Tween 20-at tartalmazó foszfát puffer oldattal (PBS-T puffer), majd rázással szárítjuk. A teljes amidolitikus aktivitás megha- 15 tározása céljából (u-PA+ pro-uPA) vájatonként 200 pj-nyi 38 mM nátrium-klorid, 50 mM pH = 8,8-as 10 g/1 BSA-t tartalmazó TRIS-pufferben (”S2444 puffer”) oldott 10 (ig/ml-es plazmin oldatot adunk a vájatokhoz. Azon vájatokhoz, ahol az 20 u-PA-t kellett meghatározni, csak „S2444 puffert adtunk. Egy órán át szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a plazmin által katalizált reakciót 035 mg/1 desztillált vizes aprotinin oldat vájatonkénti 25 pl-ének hozzáadásával leállítjuk. Az olda- 25 tot minden egyes vájatban alaposan összekeverjük, sokcsatornás pipetta segítségével, és 5 percen keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a S2444-es jelű szintetikus szubsztrát oldat (Kabi, Svédország) —1,5 mg/1 desztillált vízben oldva — 30 25 pj-ét helyezzük 1-1 vájatba, és a fentiek szerint alaposan összekeverjük. A szin előhívását 37 °C-on 2 órán keresztül lehetővé tesszük, és 405 nm-en Titertek Multiskan Photometer (Flow Laboratories, USA) segítségével olvassuk le. A minták u-PA 35 koncentrációját és az u-PA + pro-uPA összkoncentrációját úgy kaptuk meg, hogy a nem kezelt, illetve a plazminnal kezelt vájatok optikai sűrűségét interpoláljuk a standardokkal felvett dózis-hatás görbén. A pro-uPA koncentrációját a „teljes” kon- 40 centrádó és az így nyert u-PA koncentrádó közötti különbség segítségével számítottuk ki. Az I., II. és III. táblázat egy reprezentatív vizsgálat eredményeit mutatja be. Részletesebben, az I. táblázat a fenti példában 45 leírt vizsgálattal végzett u-PA és pro-uPA mérések vizsgálaton belüli és vizsgálatok közötti pontosságát mutatja be; a II. táblázat a fenti példában leírt vizsgálat szerint előállított A431-es sejt-felülúszóhoz adott ekvimoláris u-PA és pro-uPA keverék 50 analitikai visszanyerését szemlélteti, a ül. táblázat pedig a fenti meghatározásnak megfelelően mért u-PA és pro-uPA koncentrádókat mutatja be, a vizsgált minta különböző hígításai esetén. 8 I. táblázat Vizsgálaton belüli és vizsgálatok közötti pontosság A431-es sejt-felülúszóban (n=8) u-PA, NE/ml Átlag SD VK% pro-uPA, NE/ml Átlag SD VK% Vizsgálaton belüli A 159 0,10 6,780 13,6 0,93 6,860 B 7,7 0,35 4,284 20,7 1,518 7,329 Átlag 7,090 5
