201804. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására mikrobiológiai úton

HU 201804B

táblázat szerinti ferde közegen tenyésztettünk 28 *C-on 4 napig, és 30 ’C-on inkubáltunk 2 napig rázás közben.

Egy 200 ml-es kúpos lombikba 25 ml 5,0% szorbózt, melyet külön sterileztünk, 1,0% peptont, 0,5% élesztő extraktumot és 2,0% kalcium-karbonátot tartalmazó tápközeget (pH-7,0) mérünk, melyet 120*Chőmérsékleten 15percigsterüeztünk.Afenti törzstenyészet 1,0 ml-ével beoltjuk a közeget, és 30 ’C-on 2 napig inkubál juk.

A kapott tenyészetet (500 ml) szobahőmérsékleten 20 percig állnihagyjuk, ma jdaleülepedettrészeket dekántálással eltávolítjuk. A maradék folyadékot 1000 fordulat/perccel centrifugáljuk szobahőmérsékleten, hogy eltávolítsuk a főként kalciumkarbonátot tartalmazó üledéket. Az így kapott sejtszuszpenziót tovább centrifugáljuk 6000 fordulat/perccel 5 *C hőmérsékleten 10 percig, és a kapott sejteket kétszer, körülbelül 100 ml hideg sóoldattal (0,85%) mossuk, majd ismét centrifugáljuk 6000 fordulat/perccel 5 *C-on. Asejteket ismét szuszpendál juk 35 ml hideg sóoldatban (0,85%), és így mosott sejtszuszpenziót állítunk elő.

A fenti mosott sejtszuszpenzió 4 ml-éhez 300 mg L-szorbózt, 0,5 ml 2-(M-morfolino)-etánszulfonsav (MES) puffert (pH-6,5; 0,5 M) és 180 mg kalciumkarbonátot adunk, majd az elegyet 10 ml-re hígítjuk vízzel. Az elegyet egy 100 ml-es kúpos lombikban 30 percig reagáltatjuk 30 *C hőmérsékleten úgy, hogy 24 órán keresztül rázat juk. Az így kapott elegy 24,6 mg/ml 2-keto-L-gulonsavat tartalmaz (átalakítási arány; 76,0%).

7. példa

Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s, 12-5 és TH14-86 törzseket 28 ’Chőmérsékleten 4 napig ferde tápközegen tenyésztünk. Ezektől

15

elkülönítve a 4. táblázat szerinti kísérő baktériumokat ugyanilyen ferde tápközegen tenyésztjük 28 *C-on két napig. Mindegyik törzsből egy kacsnyi mennyiséggel oltjuk be egy 200 ml-es kúp formájú 5 lombikban levő 20 ml törzs tenyészet közeget (1. példa szerinti összetételű), és rázás közben (200 fordulat/perc) inkubál juk 30 ’Chőmérsékleten2napig.Ly módon különböző tenyészeteket állítunk elő.

Egy200ml-es kúp formájú lombikba 25 ml olyan 10 fermentációs közeget töltünk, mely 2,0% CSL-t,

0,3% szárított élesztőt, 0,5% ammónium-szulfátot, 0,05% Na2S203.5H20-t, 0,2% vas-szulfátot, 5,0% kalcium-karbonátot, 15,0% L-szorbózt (melyet külön sterileztünk), tartalmaz, s ezt 120 ’C-on 20 per- 15 cigsterilezzük.

A fenti tápközeget tartalmazó lombikba 1,5 ml az egyik Pseudogluconobacter saccharoketogenes (oxidativ) tenyészetből származó törzstenyészetet viszünk, és rázás közben 30 ’C hőmérsékleten 5 na- 20 piginkubálva tiszta tenyészetet állítunk elő.

Kevert tenyészet esetén a kísérő baktériumot az oxidativ törzzsel egyidejűleg ol tjük a tápközegbe oly módon, hogy 0,1 ml törzstenyészetet inokulálunk, és a beoltott közeget 30 'C hőmérsékleten inkubáljuk 5 25 napig rázás közben.

A férmén tlevekben keletkező 2-keto-L-gulonsav mennyiségét nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálattal mértük. Az eredményeket a 4. táblázat tartalmazza. A kísérő baktérium jelenléte követ- 30 keztében a 2-keto-L-gulonsav kitermelése megnőtt.

A4, táblázat a 2-keto-L-gulonsav termelését mutatja a Pseudogluconobacter saccharoketogenes törzs által a kísérő baktérium jelenlétében ill. jelenléte nélkül. A zárójelben levő számok az átalakítási 35 arányt jelentik.

16

4. táblázat

Kísérő baktérium

K591s

Pseudogluconobacter

saccharoketogenes

12-5

TH14-86

Kísérő baktérium nélkül

(mg/ml)

(mg/ml)

mg/ml)

55.3

74.1

87.6

(34.2%)

(45.8%)

(54.1%)

Bacillus cereus

87.3

101.5

125.9

IF03131

(54.0%)

(62.7%)

(77.8%)

Bacillus licheniformis IFO12201--125.0

(77.3%)

Bacillus megaterium

69.3

90.2

135.4

IFO 12108

(42.8%)

(55.8%)

(83.7%)

Bacillus pumüus

93.1

129.0

134.7

IFO 12090

(57.5%)

(79.8%)

(83.3%)

Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022--126,9

(78.5%)

Bacillus subtilis

81,7

94,4

135.3

IFO 13719

(50.5%)

(58,4%)

(83,7%)

9