201804. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására mikrobiológiai úton
HU 201804B anyagot tartalmazó lemezről egy friss teljes tápanyagot tartalmazó lemezre oltjuk át, úgy hogy 12 törzslegyen2cmhosszúságbanegylemezen.Miután 28 *C hőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáltuk, a tenyésztett sejtekből egy kacsnyit visszaviszünk 3 ml tápközeget tartalmazó vizsgálati csőbe. A közeg pH-ja 6,5, összetétele a kővetkező: 7,0% szorbóz (külön sterüezett), 1,0% szárított élesztő, l,0%pepton, 0,1% vas-klorid és 3,0% kalcium-karbonát, melyet 30 °C hőmérsékleten 4 napig rázva inkubáltunk. A vizsgált mutáns törzsek közül a TH14-86 kétszer annyi 2-keto-L-gulonsavat termelt, mint az eredeti K591S törzs azonos körülmények között. A TH 14-86 törzs oxidativ törzs, mely megnövekedett aktivitással oxidálja azL-szorbózt. 1. táblázat 13 Ferde tápközeg g/1 D-szorbit 25 Pepton 10 Élesztő extraktum 10 Agár 20 Kalcium-karbonát pH »7,0 2 2. táblázat Teljes tápközeg g/1 D-szorbit 25 Pepton 10 Élesztő extraktum 10 pH - 6,5 (Szilárd tápközeg esetén 20 g agart adunk hozzá.) 3. táblázat Minimális lényeges elemeket tartalmazó tápköz(g/l) Szacharóz 5 Kálium-hidrogénfoszfát 3 kálium-dihidrogénfoszfát 1 nátrium-szulfát 1 nátrium-ldorid 1 magnézium-szulfát.7H20 0,1 mangán-kloridjiH20 0,002 nátrium-L-glu tárnát 0,1 L-cisztein 0,1 CoA 0,002 FMN 0,002 tiamin 0,002 biotin 0,001 pH-7,0 Szilárd közeg esetén 20 g agart adunk hozzá. 3. példa A TH 14-86 mutáns törzset, melyet a Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s-ből állítottunk elő a 2. példa szerinti módon, 28 *C hőmérsékleten 4 napon keresztül tenyésztjük. Ezután egy kacsnyi sejttel 20 ml, 1. példában leírt tápközeget oltunk be200ml-es kúpos formájú lombikban, és ezt 30 °C-on 2 napig rázással inkubáljuk. 1 liter kúpos lombikba 200 ml olyan tápközeget töltünk, mely 3,0%glükózt, l,0%peptont, 1,0% szárított élesztőt, 2% kalcium-karbonátot tartalmaz, s melyet 120 'C hőmérsékleten 20 percig autoklávban sterüeztünk. Ezt a közeget 20 ml fenti tenyészettel oltjuk be, és 28 'C-on inkubáljuk 2 napig rázás közben. Ettől elkülönítve egy kacsnyi Bacillus megaterium-ot (IFO 12108) - amelyet ferde tápközegen tenyésztettünk 28 ”C hőmérsékleten 2 napig - oltunk egy 200 ml-es kúpos formájú lombikba, mely 20 ml, 4,0% szacharózt, 4,0% gyapotmag lisztet, 0,65% kálium-hidrogén-foszfátot, 0,55% kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,05% magnézium-szulfátot, 0,05% ammónium-szulfátot, 0,05% nátrium-kloridot és 0,05%kalcium-pantotenátot (pH-7,0) (melyet 120 ’C-on 20 percig autoklávban sterüeztünk) tartalmaz, és 30 °C-on 3 napig inkubáljuk. A kapott fermentlevet 120 'C-on 20 percig sterilezzük, hidegben tároljuk, és az alábbiakban említett fermentációs közeg komponenseként használjuk. így egy 51-es üveg fermentorba 31 élesztő tápközeget töltünk, amely 12,5% L-szorbózt (120 *C-on külön sterilezve 15 percig), 0,5% ammónium-szulfátot, 0,03% kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,05% Na2S203.5H20-t, 0,05% magnézium-szulfátot, 0,1% FeS04.7H20-t, 5 pg/ml MnS04.4H20-t, 5 p.g/ml tiamint, 0,1 |xg/mlbiotint,0,l (ig/mlFMN-t, 5,0% kalcium-karbonátot, és 4,0 t/t% fenti sterüezett tápközeget - mely Bacülus megateriumot tartalmaz, és 120 'C-on 30 percig autoklávban sterilezőnk - tartalmaz. Ebbe a fermentációs közegbe 300 ml fenti tenyészetet oltunk, és 32 °C hőmérsékleten 2,4 liter/perces levegőztetéssel és 800 f ordulat/perccel 3 napig keverjük. A kapott fermentlé 102,0 mg/ml 2-keto-L- gulonsavat tartalmaz. Átalakítási arány: 75,7%. A fermentlé 1 literét az 1. példa szerint tisztítva 73,2 g mononátrium-2-keto-L-gulonát-monohidrát sót kapunk. 4. példa Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5 törzset az 1. példa szerint inkubálunk, így egy törzstenyészetet állítunk elő. Ezt a törzstenyészetet egy 200 ml kúpos lombikban levő, 20 ml, 9,0% L-szorbózt tartalmazó 3. példában leírt fermentációs közegbe, melyet 120 'C-on 20 percig sterüeztünk, oltjuk. A tenyészetet 32 'C-on 2 napig inkubáljuk. A kapott fermentlé 73,2 mg/ml 2-keto-L-gulonsavat (átalakítási arány: 75,4%) tartalmaz. 5. példa Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4, 12-15 és 22-3 törzseket külön-külön a 4. példa szerint rázás közben inkubálunk a 4. példa szerinti módon. A 2-keto-L-gulonsav mennyisége a fermentlében a 12-4 esetén 52,1 mg/ml (konverziós arány: 53,7%), a 12-15 törzs esetén 48,7 mg/ml (átalakítási arány: 50,2%), míg a 22-3 törzs esetén 69,3 mg/ml (átalakítási arány: 71,4%). 6. példa Egy 200 ml-es kúpos lombikba 25 ml olyan közeget mérünk, mely 1,0% L-szorbózt (külön sterüezett), 0,5% peptont, 0,5% élesztő extraktumot tartalmaz, s melyet 120 'C hőmérsékleten 15 percig sterilezőnk. A lombikba egy kacsnyi Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86-ot adunk, melyet az 1. 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
