201804. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására mikrobiológiai úton
HU 201804 B stb. meghatározásával állapítottuk meg. A 2-keto-L-gulonsav mennyiségét a reakcióelegyben vagy tápközegben nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (mobil fázis: híg kénsav, pH-2,2; folyási sebesség: 0,5 ml/perc; detektor: differenciál refraktométer) határoztukmegegy szulfonált polisztirol-gél oszlopot (Shimadzu Seisakusho, Ltd. Japán, SCR-101H oszlop, 7,9 mm x 30 cm) alkalmazva. Standardként 2-keto-L-gulonát-monohidrát nátriumsójának kristályait használtuk. A 2- keto-L-gulonsavat vékonyréteg kromatográfiásan detektáltuk. Ekkor egy ceúulóz lapra (Merck, USA) mintát vittünk fel, és miután fenol(víz) hangyasav 75:25:5 térfogatarányú elegyével 3 órán keresztül szobahőmérsékleten kifejlesztettük a kromatogramot,alapotmegszárítottukésegyszínreagensselkezeltük. A 2-keto-L-gulonsav Rf értéke kb. 0,30 volt, mely ezüst-nitráttal bamásfekete, o-fenüén-diaminnal sárga ill. anüin-ftálsawal rózsaszín foltot adott. A 2-keto-L-gulonsav jó kitermelsésel állítható elő a találmány szerinti eljárással egy Pseudogluconobacter saccharoketogenes fajhhoz tartozó mikroorganizmust alkalmazva, mely az L-szorbózt 2- keto-L-gulonsawá képes oxidálni. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. A példákban a %-ok tömeg/térfogat%-ot jelentenek. 1. példa Egy200 ml-es Erlenmeyer-lombikba 20 ml olyan törzstenyészet-közeget mérünk be, amely 2,0% glükózt, 1,0% peptont, 1,0% szárított élesztőt és 2,0% kalcium-karbonátot tartalmaz, s melyet 120 ’C-on 20 percig sterileztünk autoklávban. A lombikba levő közeget 1 kacsnyi Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s-selinokuláljuk, melyet az 1. táblázat szerinti ferde tápközegben tenyésztettünk 28 ’C-on 4 napig és 30 'C hőmérséleten 2 napon keresztül rázással (200 fordulat/perc) inkubáltunk. Akapott tápelegy 2 ml-ét a fentivel azonos összetételű tápközegbe oltjuk, és ugyanilyen körülmények között inkubálva törzstenyészetet kapunk. Egy 200 ml-es kúp alakú lombikot 25 ml olyan fermentációs közeggel töltünk meg, amely 2,0% CSL-t, 0,5% szárított élesztőt, 0,5% ammóniumszulfátot, 0,05% Na2S203.5H20-t, 0,2% vas-szulfátot, 4,0% kalcium-karbonátot és 10,0% L-szorbózt (elkülönítve sterilezve) tartalmaz, s melyet 120 ’C- on 20 percig autoklávban sterileztünk. A fenti tápközeget tartalmazó kúpos lombikba 1,25 ml fentiekben előállított törzskultúrát inokulálunk, és 30 ‘C hőmérsékleten 3 napon keresztül való keveréssel inkubáljuk. A nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint a kapott fermentlé 60,5 mg/ml 2-keto-gulonsavat (átalakítási arány: 56,1 %) tartalmaz. A fenti fermentlé 1000 ml-ét centrifugálva a sejtből származó és egyéb kiülepedett részeket eltávolítjuk. A felülúszót (980 ml) Amberlite IR 120 (Rohm and Haas Co., USA, H-forma, 500 ml) oszlopon vezetjük keresztül, melyet 300 ml ionmentesített vízzel mo-11 síink. Az átfolyt anyagot és a mosófolyadékot egyesítjük, és egy 500 ml-es aktív szenet tartalmazó oszlopon vezetj ük keresztül, majd kb. 300ml ionmentesitett vízzel mossuk a kationok és a szín eltávolítása céljából. Az átfolyt anyagot és a mosófolyadékot egyesítjük (1600 ml), a pH-ját nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be, és csökkentett nyomáson 50 *C-on kb. 70 ml-re pároljuk be. Ezt a koncentrátumot 5 ’C-on 24 órán keresztül állni hagyjuk, így színtelen prizmákat kapunk. A prizmákat leszűrjük, kis mennyiségű hideg metanollal mossuk és foszfor-pentoxidon szárítjuk szobahőmérsékleten, csökkentett nyomáson. így 37,5 g mononátrium-2-keto-L-gulonát-monohidrátot kapunk. Olvadáspont: 147-155 ’C (bomlik) Elemanalízis a C6Hg07Na.H20 képlet alapján: Számított: C: 30,78%; H; 4,74%; Talált: C-30,94%; H: 4,85%. Optikai forgatóképesség [a]Z4D - -23,3’ (c-1,0, víz) A nagynyomású folyadékkromatográfiás retenciós időt, a vékonyrétegkromatográf iásRf értéket és színt tekintve a termék azonos volt az autentikus mintával. 2. példa Egy 16 mm x 160 mm-es vizsgálati csövet 5 ml 2. táblázat szerinti teljes tápközeggel töltünk meg, majd egy kacsnyi Pscudogluconobacter saccharoketogenes K591s-sel inokuláljuk, melyet az 1. táblázat szerinti ferde tápközegben tenyésztettünk és 30 ’C hőmérsékleten 2 napon át rázva inkubáltunk. A kapott tenyészetből 1 ml-et 5 ml ugyanilyen tápközeget tartalmazó vizsgálati csőbe viszünk, melyet 4 órán keresztül rázva inkubáltunk. A kapott 5 ml-nyi közeget aszeptikus körülmények között centrifugáljuk (12.000 fordulat/perc) 5 °C-on 15 percig, hogy begyűjtsük a sejteket. A sejteket 10 ml triszmaleinsav puff erben (pH - 6,5; 0,05 M) szuszpendáljuk, majd ismét centrifugáljuk. A fenti eljárást kétszer megismételjük, és a mosott sejteket 5 ml fenti puff erben, mely 1 mg/ml nitrozoguanidint tartalmaz, szuszpendáljuk, és 30 ’C hőmérsékleten 2 órán keresztül rázzuk, hogy mutánst képezzünk. A szuszpenziót centrifugáljuk (12.000 fordulat/perc) 5 "C hőmérsékleten 15 percig, hogy elválasszuk a sejteket, melyeket kétszer 10 ml trisz-maleinsav pufferrel mosunk, és így nitrozoguanidinnel kezelt sejtfrakciót különítünk el. Ezt 0,85%-os sóoldattal megfelelő koncentrációra hígítjuk, és egy 9 cm átmérőjű lemezen, mely 15 ml teljes szilárd táptalajt tartalmaz, kenjük el. Az inokulált lemezt 28 "C-on 5 napig tartjuk. A telepeket megszámoljuk, és összehasonlítjuk a kezeletlen kontrollal. A nitrozoguanidin kezelés következtében a mikroorganizmusok mortalitása 90,4%. A teljes táptalajon levő tenyészeteket a 3. táblázat szerinti minimális lényeges tápanyagokat tartalmazó táptalajokra oltjuk át, és miután 3 napon keresztül 28 °C-on inkubáltuk, az auxotrofok (táplálkozási mutánsok) gyakoriságát vizsgáljuk. Ez a gyakoriság kb. 6,6% volt. A mutagénnel kezelt tenyészeteket a teljes táp-12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
