201804. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására mikrobiológiai úton
HU 201804B Bármely fenti törzset megfelelő közegben 20- 40 °C hőmérsékleten inkubálhatunk 1-4 napig, majd a kapott tenyészetet inokulumként alkalmazhatjuk a találmány szerinti eljárás során. Az inokulum mérete általában 1/10-1/1000 között változik az oxidativ törthöz viszonyítva. Amennyiben a járulékos törzset ilyen mennyiségben inkubáljuk az oxidativ törzzsel, az oxidativ törzs növekedését oly módon javítja, hogy az oxidativ törzs tiszta kultúrájával összehasonlítva, a kevert tenyészet nagyobb koncentrációban, rövidebb idő alatt képes L-szorbózból 2-keto-L-gulonsavat előállítani. A járulékos baktériumként használt törzsek előnyösen olyanok, amelyek L-szorbózból 2-keto-L- gulonsavat kevéssé vagy egyáltalán nem tudnak előállítani. Különben ugyanolyan tenyésztési körülményeket alkalmazhatunk, mintha az oxidativ törzset önmagában használnánk. A fenti mikroorganizmusok tenyésztésére használt közeg szilárd vagy folyékony lehet, s olyan tápanyagokat tartalmaz, amelyet az adott törzs hasznosít. Azonban ipari méretű eljárás esetén a folyékony tápközeg előnyös. A közeg tartalmaz szénforrásokat, nitrogén forrásokat, szervetlen sókat, szerves sav sókat, és nyomnyi mennyiségben olyan anyagokat, melyeket általában használnak mikroorganizmusok tenyésztéséhez. Míg a kiindulási anyagként használt L-szorbóz szénf orrásként szolgál, egyéb segéd -szénf orrásokat, például glükózt, glicerint, szacharózt, laktózt, maltózt, melaszt stb. szintén alkalmazhatunk. Nitrogénforrásként például különböző szervetlen és szerves nitrogéntartalmú vegyületet vagy nitrogénvegyületet, például ammónium-sókat (például ammónium-szulfátot, ammónium-nitrátot, ammónium-kloridot, ammonium-foszfátot stb.) kukoricalekvárt (GSL), peptont, húsextraktumot, élesztő extraktumot, szárított élesztőt, szójalisztet,gyapotmag lisztet, karbamidot stb. használhatunk. Szervetlen sóként kálium-, nátrium-, kalcium-, magnézium-, vas-,mangén-,kobalt-, cink-,réz-és/vagyfoszforsav sóit alkalmazhatjuk. Nyomnyi mennyiségű tápanyagként a koenzim- A-n kívül pantoténsavat, biotint, tiamint és riboflavint alkalmazhatunk, melyek a fenti mikroorganizmusok növekedéséhez feltétlenül szükségesek, de használhatunk olyan anyagokat is, melyek meggyorsít ják a mikroorganizmus növekedését ill. üy módon az 2-keto-L-gulonsav képződést, például flavin mononukleotidot (FMN), flavin-adcnin dinuklcotidot (FAD), egyéb vitaminokat, L-ciszteint, L-glutaminsavat, nátrium-tioszulfátot stb. vagy tiszta vegyületek, vagy ezeket tartalmazó természetes anyagok formájában, megfelelő mennyiségben. A tenyésztési módszert illetően bármely stacionárius, rázó, alámerítéses stb. eljárás alkalmazható. Ipari méretű eljárásra azún. alámerítéses tenyésztési eljárás az előnyös. Természetesen a tenyésztési körülmények a baktérium törzstől, a tápközeg összetételétől és egyéb faktoroktól függnek, és minden esetben úgy kell megválasztanunk őket, hogy a kívánt vegyületet a lehető legnagyobb hatékonysággal kapjuk. így például az inkubációs hőmérséklet előnyösen 9 25-35 *C lehet, és a közeg pH-ja kb. 5-9. Ha a tenyésztést a fenti körülmények között 10- 120 órán keresztül folytatjuk, a 2-keto-L-gulonsav a legnagyobb koncetrációban képződik. Mivel a közeg pH értéke általában a kívánt vegyület képződésével csökken, előnyös, ha egy bázikus anyagot, például nátrium-hidroxidot, kálium-hidroxidot vagy ammóniát adunk időről időre a tápközeghez, hogy a közeg pH-ját optimális értéken tartsuk a 2-keto-L-gulonsav termelés szempontjából, vagy a tápközeghez egy megfelelő puffert adunk, hogy a közeg pH-ját állandó értéken tartsuk. A fentiektől függetlenül, a közeg további komponenseiként az oxidativ törzseken kívül a tápközeg előnyösen egyéb sterüezett baktériumot is tartalmazhat. Ilyen baktériumokra példaként a Bacillus, Pseudomonas, Citrobacter, Escherichia, Erwinia nemzetségekbe tartozó törzseket említhetjük. Konkrét példaként a következő törzseket sorolhatjuk fel: 10 Bacillus cereus EF03131 Bacillus subtilis IFO3023 Bacillus pumilus IFO12089 Bacillus megaterium IFO12108 Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 Pseudomonas trifolii IFO 12056 Citrobacter freundii HO 12681 Escherichia coli IFO 3546 Erquinia herbicola IFO 12686 így ezeket a baktériumokat egy olyan közegben inkubáljuk, mely lehetővé teszi növekedésüket 20- 40 °C hőmérsékleten, 2-4 napon keresztül, és a kapott tenyészközeget sterüezzük, majd az oxidativ törzs közegéhez adjuk 0,5-5,0 térfogat/térfogat% arányban. így az oxidativ törzs növekedését meggyorsíthatjuk. A reakcióelegyben vagy tápközegben így képződött és felhalmozódott 2-keto-L-gulonsavat önmagában ismert módon, a vegyület tulajdonságait felhasználva különíthetjük el és tisztíthatjuk. A 2- keto-L-gulonsavat a szabad sav vagy például nátrium-, kálium-, kalcium-, ammonium- vagy hasonló sója formájában különíthetjük el. Bármely el j árás, amely a kívánt vegyület kinyerésére alkalmas, megfelelő. Például a tápközegből elválaszthatjuk a sej teket, például szűréssel, centrifugálással vagy aktív szénnel való kezeléssel, és az oldatot bepároljuk. A kicsapódott kristályokat kiszűrjük, és átkristályosítva a kívánt vegyületet kapjuk. Ezen kívül oldószeres extrakciót, kromatográfiát, kicsapást vagy kisózást, és egyéb módszereket is használhatunk megfelelő kombinációban és/vagy ismétléssel. Amikor a 2-keto-L-gulonsavat szabad sav formájában kapjuk, sóvá alakíthatjuk például nátrium-, kálium-, kalcium-, ammonium-vagy hasonló sójává ismert módon. Amikor a kívánt vegyületet sója formájában nyerjük ki, a szabad savat képezhetjük vagy más sót képezhetünk belőle ismert módon. A találmány szerinti termék 2-keto-L-gulonsavval való azonosságát a kapott termék fizikai-kémiai konstansainak, például elemanalízis, olvadáspont, optikai forgatóképesség, IR abszorpciós spektrum, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
