201803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina hatóanyagát képező polipeptidek előállítására
HU 201803B cil-szuifát (SDS), 0,1% brómfenolkék) újraszuszpendáljuk és 105 "C-os melegítő egységben 5 percen át melegítjük. A proteineket SDS-PAGE segítségével elválasztjuk (13% akril-amid, 30:0,8 akrilamid:bisz(akril-amid) arány). A proteineket nitrocellulózra visszük és az E. coliban termelődött CS- protein ún. western biot analízissel mutatjuk ki, a P. falciparum tetrapeptid ismétlődő szakaszával reagáló öt monoklonális antitestet használva (Dame és munkatársai fent idézett munkája). 2. példa R16tet86 polipeptid 100 pg tisztított pUC8 1. klón DNS-t 40 egység Xho II restrikciós endonukleázzal emésztünk, 400 pl puffer-közegben, 37 °C-on, 16óránát.ACS- protein 16 tetrapeptid ismétlődő egységét kódoló, 192 bázispárból álló fragmentumot ezután PAGE segítségével izoláljuk. ApASl expressziósvektortaz 1. példában ismertetett módon Bam Hl restrikciós endonukleázzal hasítjuk. 1 pg 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot 100 ng pAS 1 -hez kötünk, annak Bam Hl helyén, az 1. példában leírt módon. A ligációs elegyet E. coli MM294C1+ törzsbe transzformáljuk. Egy, a pASl Bam Hl helyén megfelelő orientációban egy 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot tartalmazó klórt azonosítottunk, a plazmid Bam HI-Hind II fragmentumának poli(akrüamid) gél-elektroforézisével, amelynek Hin II helye a tetR géntől lefelé helyezkedik el, és a Bam Hl hely a eil ATG és a beillesztett fragmentum csatlakozásánál van a helyesen orientált plazmidban. A fenti pR16tet86 plazmid szerkezete az alábbi: pBR322 PL ismétlődő egység tetR S pBR322 7 BH BB ahol BH jelentése Bam Hl hely, B jelentése Ban II hely és S jelentése terminációs kodon. A pR16tet86-tal transzformáljuk az E. coli N5151 törzset (clts857) és a CS-protein tetrapeptid ismétlődő egységének termelődése szempontjából vizsgáljuk, western biot analízissel. A képződött protein szerkezete az alábbi: N-Met-Asp-Pro- (Asn-Ala-Pro)i s-(Asn-Val- Asp-Pro)i-T86-C ahol T86 a pASl-ben levő tetraciklin rezisztencia génből származó 86 aminosavat jelenti. Az N-terminális metionin (Met) aminosavmaradék szintén a vektorból származott, közelebbről a cH protein iniciációs kodonból. 2A. példa R32tet86 és R48tet&6polipeptidek 10 pg tisztított pR16tet86plazmid DNS-t 25 egység Bam Hl restrikciós endonukleázzal emésztünk 200 pl puffer-közegben, 37 'C-on, 2 órán át. Afenti DNS 100 ng-ját ezután 1 pg fent ismertetett 192 bázispárból álló Xho II fragmentummal kapcsoljuk össze. Előállítjuk az alábbi szekvenciájú polipeptideket kódoló expressziós vektorokat: N-Met-Asp-Pro- [Asn-Ala-Asn-Pro)i5-(Asn- Val-Asp-Pro) i ]n-T86-C, ahol n értéke 2 (R32tet86), vagy n értéke 3 (R48tet86), és azokat E. coliban fejezzük ki. Azokat a pASI kiónokat, amelyekben n értéke 2 vagy 3, elválasztjuk azoktól a kiónoktól, amelyekben n értéke 2-től vagy 3-tól eltérő, mint azt fent ismertettük. Minden egyesvizsgáltklónahelycs orientációban tartalmazza a beépült fragmentumot. Mind az R32tet86, mind az R48tet86 közel azonos mértékben expresszálódott az R16tet86-tal, amint azt immun-lenyomatos analízissel (immunoblotting) kimutattuk. Az Rtet86proteinek immun-lenyomatos analízisével kimutatható volt a termékek heterogén összetétele, amelyet Coomassie Brilliant Blue R-250-es festéssel nem lehetett látni. Ezek a proteinek úgy tűnik, hogy közel fele mennyiségben az alább ismertetett Rtct32 polipeptidekből állnak. Úgy tűnt, hogy a kisebb degradációs termékek mérete arányos a kiónban levő tetrapeptid ismétlődő egységek számával. A fenti proteinek instabilitása a heterológ COOH-terminális vég degradációjának tulajdonítható valószínűleg. 3. példa R16tet32 polipetid 10 pg tisztított pR16tet8őDNS-t25 egység Ban II restrikciós endonukleázzal hasítunk, 200 pl pufferközegben, 37 "C-on, 2 órán át. A fenti hasított DNS 100 ng-ját ezután ligázzal zárjuk. A fenti művelet eredményeként töröltünk egy 14 bázispárból álló Ban II fragmentumot, és egy terminációs kodon alakult ki éppen a megmaradt Ban II helytől lefelé. Az így kapottpR16tet32plazmidothasználjukfelE. coli N5151 törzsben azR16tet32 kifejezésére, majd a tenyészetből tisztítjuk az RÍ 6tet32-t. Az R16tet32-t tartalmazó E.coli 30 g-ját (nedves tömeg) 200 ml A-puffrben (50 mmól/1 Tris-HCl, pH 8,0, 2 mmól/1 etüéndiamin-tetraecetsav (EDTA), 0,1 mmól/1 ditiotreitol, 5 térfogat% glicerin) űjraszuszpendáljuk. 0,2mg/mlvégkoncentrációbanlizozimetadunkhozzá, és az elegye t jégen 30 percen á t inkubálva lizál juk a sejteket. Az elegyet ezután Waring homogenizátorban 3 percen át magas fordulatszámot alkalmazva kezeljük, majd 1 percen át Brason 350 szonikátorban ultrahangos kezeléssel szétnyirjuk a bakteriális DNS-t. 0,1 vegyes% végkoncentrációban nátrium-dezoxi-kolátot adunk az elegyhez, és 30 percen át centrifugálva eltávolítjuk a sejt-törmelékeket. A felülúszót egy lombikban összegyűjtjük és forró vízfürdőn 10 percen át inkubáljuk, majd 12000g-vel 30 percen át centrifugáljuk. Azt tapasztaltuk, hogy közel az összes E. coli protein kicsapódott a hőkezelési lépés alatt, és kiülepedett a centrifugáláskor, míg az R16tet32 protein oldatban maradt és a felülúszóban gyűlt össze. A felülúszót öszszegyűjtjük és 20%-os telítettséget biztosító koncentrációban lassan ammónium-szulfátot adunk hozzá. A fenti módon szelektíven kicsapódott R16tet32-t centrifugálással (12000 g, 30 perc) öszszegyűjtjük. Ezen a ponton az R16tet32 protein 95%-nál nagyobb tisztaságú, az egyéb szennyező bakteriális proteinek tekintetében. Az egyéb anyagok - például proteinek, szénhidrátok, nukleinsavakvagy lipopoliszacharidok - által okozott maradék szennyezést egy végső kromatográfiás tisztítással - például ioncserélőskromatográfiával, fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával, fenü-Sepharose kromatográfiával, 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
