201803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina hatóanyagát képező polipeptidek előállítására
HU 201803B méret szerinti elválasztással stb. - távolíthat jukel. A képződött tisztított R16tet32 közel 5%-át teszi ki az összes E. coli proteinnek, azaz 30-60 mg/1 koncentrációjú, amintaztCoomassieBluefestésselmegállapítottuk. Az RÍ 6tet32 szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro- [(Asna-Ala-Asn-Pro) i s(Asn- Val-Asp-Pro)i]n-T32-C, n értéke 1 és T32 a tetraciklin rezisztencia génből származó 32 aminosavat jelenti. Közelebbről, a T32 szekvenciája az alábbi: -Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His-Arg-Arg-His-Arg-Cys-Gly-Cis-Trp-Arg-Leu-Ty r-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser-Gly-Se r-C, a megmaradt Ban II hely a 30. és 31. aminosav között van. 3A. példa R32tet32ds R48tefi2 polipeptidek Lényegében a 3. példa szerint eljárva állítjuk elő az R32tet32-t és R48tet32-t (azaz egy olyan R16tet32-nek megfelelő szekvenciát, amelyben n értéke 2, illetve 3) E. coliban, és azonos hozammal és tisztasági fokkal izoláljuk, mint azR16tet32-t. Kiindulási vektorként pR32tet86-ot, illetve R48tet86-ot használunk. 3B. példa R64tet32 és R80tet32 polipeptid 10 (j.g tisztított pR48tet32plazmid DNS-t 25 egység Bam HI-val emésztünk 200 pl puffer-közegben, 37 'C-on, 2 órán át. 100 ng fenti DNS-t ezután 1 p.g fent ismertetett, 192 bázispárt tartalmazó Xho II fragmentummal kapcsolunk össze. Előállítjuk az alábbi szekvenciájú polipeptideket kódoló plazmid expressziós vektorokat: N-Met-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) 15-(Asn- Val-Asp-Pro)i]nT32-C, ahol n értéke 4 (R64tet32) vagy n értéke 5 (R80tet32), és azokatE. coliban kifejezzük. Azokat apASl kiónokat, amelyekben n értéke 4 vagy 5, azoktól a kiónoktól, amelyekben n értéke 4-től vagy 5 tői eltérő, a fent leírt módon elválasztjuk. Az R64tet32, és az R80tet32 közel azonos mértékben expresszálódott, mint az R48tet32. Az R64tet32-t lényegében az R16tet32, R32tet32 és R48tet32 előállításával kapcsolatban ismertetett módon tisztítjuk. 3C. példa R96tet32 és RÍ 12tetyipolipeptid Lényegében a 3B. példában leírtak szerint eljárva állítjuk elő az R96tet32 és RÍ 12tet32 polipeptideket (amelyek képletében n értéke 6, illetve 7), az R48tet32-vel közel azonos mennyiségben.Kiindulási vektorként pR80tet32-t használunk. Noha a tisztított Rtet32 polipeptidekben észlelhető bizonyos mértékű heterogenitás immun-lenyomatos módszerrel a reakcióképes fő foltok összhangban vannak a protein-festéssel kimutatható sávokkal. Az SDS-PAGE módszerrel meghatározott molekulatömegek a vártnál kb. kétszer nagyobbak, noha az egyes proteinek vándorlása minden egyes előállított polipeptid esetén arányos a tetrapeptid 9 ismétlődő egységek számával. Néhány esetben meghatároztuk az Rtet32 peptidek aminosav-összetételét is, amelyek a várt értékeknek megfeleltek. 4. példa R16G polipeptid A pAS 1 Bam Hl helyére egy 5’-AGTCCCGGGTGACTAGCTGA -3’ 3’ GGCCCACTGACTGACTCTAG -5’ szekvenciájú szintetikus kötőt illesztve pTerm-et állítunk elő. 10 p.g pASl-et 25 egység Bam HI-vel emésztünk. 100 ng Bam Ill-vel hasított pASl-et 20 ng szintetikus kötővel kötünk össze, és a pTerm plazmidot mint a pASl Bam Hl helyén egy beépült kötő-szekvenciát tartalmazó plazmidot azonosítjuk. A fenti vektorban megmarad a Bam Hl hely, és a TGA terminációs kodonoknak a cll protein ATG iniciációs kodonjától lefelé való beillesztését eredményezi, mind a három leolvasási rendszerben. ApRl 6G plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pUC8 1. kiónjából származó 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot a pTerm Bam Hl helyre illesztjük, és kiválasztjuk a fent ismertetett módon azokat a kiónokat, amelyek megfelelő orientációban tartalmaznak egyetlen Xho II betoldást. A pR16G-t lényegében a fent ismertetett módon klónozzuk és fejezzük ki E. coli N5151 törzsben. Az RI 6G szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro) 15-(Asn- Val-Asp-Pro)i]n-Gly-C, aholnértéke 1. A fenti proteinben nincs aromás gyűrűs aminosavmaradék, így a képződött polipeptid mennyiségét nem tudjuk Coomassie Brilliant Blue R-25-es festéssel vizuálisan meghatározni. A CS-proteinre specifikus 5 monoklonális antitesttel végzett immun-lenyomatos analízis (lásd Dame és munkatársai fent idézett munkája) szerint a kívánt polipeptid közel 1%-át teszi ki az összes sejt-proteinnek, az R16tct32-vel összehasonlítva, amely utóbbinál lehetséges Coomassie Brilliant Blue R-25-es festéssel meghatározni a protein-tartalmat. 4A. példa R32G, R48G, R64 G, R80G és R112G polipeptid Az R32G, R48G, R64G, R80G és RI 12G polipeptideket - amelyek szekvenciája azonos azRl 6G- vel, de n értéke 2,3,4,5, Uletve - a 4. példában ismertetett módon E. coli N5151 törzsben termeljük. A fenti polipeptidek közel azonos mennyiségben képződnek, mint az R16G. Az R48G-t lényegében a 3. példában leírtak szerint tisztítjuk. 5. példa RI 6LA és R32LA polipeptid A pAS 1 Bam Hl helyére egy 5’-AGTCCCGCTGCGTT -3’ GCGACGACAACTAG -5 ’ szekvenciájú szintetikus kötőt illesztve pTerm2-t állítunk elő, lényegében a 4. példában leírt módon. A pTerm2-ben megmarad a Bam Hl hely. A pUC8 1. kiónból származó 192 bázispárból álló Xho II frag10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
