201803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina hatóanyagát képező polipeptidek előállítására
HU201803B raszűrés előtt felületaktív szert adunk a rendszerhez, a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek oldatban tartására. A találmány szerinti eljárás egyik lényeges elemét az a felismerés képezi, hogy a találmány szerinti eljárással előállított bizonyos polipeptideket úgy választhat juk el igen nagy hatékonysággal az egyéb polipeptidektől, ha a tisztított extraktumot a protein oldatban tartására adott detergens beadagolása után közel 80 "C-ra melegítjük. Azt tapasztaltuk, hogy ha az extraktumot 80 °C-on legalább 4 percen át melegítjük, csaknem az összes bakteriális polipeptid kicsapódik, anélkül, hogy a lényegében az ismétlődő egységekből álló, vagy az ismétlődő egységek más, nem hőre denaturálódó szekvenciákhoz való kapcsolódásából álló polipeptidek denaturálódnának. A denaturált bakteriális polipeptideket centrifugálással tömöríthetjük és eltávolíthatjuk. Afenti eljárás azRtet32, RG, RLA és Rtet86 polipeptidek tisztítására használható. Közelebbről, a fenti eljárást sikeresen alkalmaztuk az R16tet32, R32tet32, R48tet32, R64tet32, R48G, R32LA és R16tet86 tisztítására, amint azt a példákban ismertetjük, míg azRlóNSl ésR32NSl melegítése ezen polipeptidek kicsapódását okozta. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet tovább tisztíthatjuk, például szelektív kicsapószer hozzáadásával, majd egy kromatográfiás lépéssel, például ioncserélő kromatográfiával vagy fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával. A találmány szerinti eljárással előállított vakcinábana találmány szerin ti eljárással el őállítot t poli - peptid vizes, előnyösen fiziológiás pH-n pufféról t oldatát közvetlenül használhatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet - liofüizálás után vagy anélkül - különféle ismert adjuvánsokon is adszorbeálhatjuk vagy azokkal keverhetjük. A fenti adjuvánsok többek között alumínium-hidroxid, muramü-dipeptid vagy szaponinok, így Quil A lehetnek. További alkalmazási módként például a polipeptid mikrorészecskékbe - például liposzomákba - való kapszilázását említhetjük. Úgy iseljárhatunk, hogy a polipeptidet egy immunstimuláló makromolekulával - például elölt Bordatellával vagy egy tetanusz toxoiddal - kapcsoljuk össze. A vakcinák előállítását például a New Trends and Development in Vaccines, szerk. Voller és munkatársai, University Park Press, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, 1978 irodalmi helyen ismertetik általánosan. A liposzomákba való kapszulázást például Fullerton (US-PS 4 235 877) ismertette. Ä proteinek makromolekulákhoz kapcsolását például Likhide (US-PS 4 372 945) és Armor és munkatársa (US-PS 4 474 757) írtak le. A Quü A használatát például Dalsgaard ésmunkatársai (Acta Vet. Scand. 18,349/1977/) munkájából ismerjük. A vakcina-dózisokban a polipeptid mennyiségét úgy választjuk meg, hogy azzal az immunprotektív válasz elérhető legyen, a szokásos vakcinák hátrányos mellékhatásai nélkül. A fenti dózis az alkalmazott specifikus polipeptidtől, valamint attól függ, hogy a vakcina adjuvánst is tartalmaz-e. Általában minden egyes dózis 1-1000 pg, előnyösen 10-200 pg polipeptidet tartalmazhat. Az egyes vakcinák op5 timális dózisát szokásos módon, például az antitesttiter meghatározásával vagy a kezelendő alany más válaszának mérésével határozhatjuk meg. Az első vakcinálást követően a kezelt alany előnyösen kb. 4 hét múlva újabb adagot kap, és ezt követően minden 6 hónapban megismételjük az adagolást, egészen a fertőzésveszély fennállásáig. A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni. A CS-proteint kódoló szekvenciát James Webrtől (Walter Reed Army Institute for Research) kaptuk, egy standard E. coli klónozó vektorba, a pUC8-ba (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, Amerikai Egyesült Államok) az Eco RI helynél illesztett XmPFl (Dame és munkatársai, fent idézve) 2337 bázispárból álló Eco Rí fragmens formájában (lásd la. ábra). A kapott pUC8 származékot a továbbiakban pUC8 1. klóronnak nevezzük. 1. példa CS-protein származék 40 pg tisztított pUC8 1. klón plazmíd DNS-t 100 egység Stul 100 egység Rsal restrikciós endonuldeázokkal emésztünk, 400 pl puffer-közegbcn (amelynek összetétele 50 mmól/l Tris, pH 7,5, 50 mmól/l NaCl, 1 mmól/l ditiotreitol (DTT) és 10 mmól/l MgCl2), 37 °C-on, 1,5 órán át. A kapott, a CS-protein első 18 aminosavját kódoló, 1216 bázisból álló fragmentumot 5% poli(akril-amid)-gélen elektroforézissel (PAGE) választjuk el. 10 pgpASl expresszi ós vektor 200 pl puffer-közegben 1,5 órán át, 37 °C-on 25 egység Bam Hl restrikciós endonukleázzal emésztünk. A szétvágott plazmidot ezután DNS-polimeráz nagy fragmentummal (Klenow, 5 egység; 20 mmól/l Tris-HCl, pH 7,5, 7 mmól/l MgCl2,60 mmól/l NaCl, 6 mmól/l 2- merkapto-etanol és 0,25 mmól/l a négy dezoxinukleotid-trifoszfát mindegyikéből; 25 °C, 15 perc kezeljük, a Bam Hl helynél a vég betöltésére. A CS-gén fragmentum 1 pg-ját ezután 100 ng fenti vektorral kötjük össze, 30 pl ligáz-pufferben (50 mmól/l Tris, pH 7,5, 1 mmól/l DTT, 10 mmól/l MgCl2, 100 pmól/1 rATP), 1 egység T4-DNS lígáz segítségével, 16 órás reakcióidőt alkalmazva, 4 °C- on. A ligációs elegyet E. coli MM294CÚ törzsbe (Ann. N.Y., Acad. Sei. 478,233-248) transzformáljuk, ampicillin-rezisztens telepeket kapunk, és ezeket vizsgáljuk a CS-gén fragmentum pASl-bc való beépülése szempontjából. Egy megfelelő szerkezetűnek talált plazmidot (pCSP) azonosítás után E. coli N5151 törzsbe transzformálunk (clts857) (Mol.Cell.Biol. 5(5), 1015-1024, 1985) és a teljes hosszúságú CS-protein expressziója szempontjából vizsgáljuk. (AproteinN-terminálisánála 18aminosav törlése az autentikus CS-protein hasított szignál-peptidjének felelne meg.) Ä sejteket Luria-Bertani tápközegben (LB) tenyésztjük 32 °C-on, amíg a tenyészet abszorpciója 650 nm-en (Aóso) eléri a 0,6 értéket, majd a hőmérsékletet 2 órán át 42 'C-on tartjuk, az expressziós plazmid PL-promoterc transzkripciójának beindítására és a CS-protein származék ezt követő transzlációjára. A sejttenyészetből 1 ml-es mintákat veszünk, tömörítjük, lizáló pufferben (10 mmól/l Tris-HCl, pH 7,8,25 térfogat% glicerin, 2% 2-merkapto-etanol, 2% nátrium-dode-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
