201803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina hatóanyagát képező polipeptidek előállítására
HU 201803B Rtet86 polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és C-terminális végükhöz egy tetR gén termék van fuzionálva; RNS1 polipeptidek, amelyeklegalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez az NS1227 aminosavja kapcsolódik; NSIRpolipeptidek, amelyeklegalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok N-terminális végéhez azNSl N-terminális 81 aminosavja van fuzionálva; RG polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy glicin-aminosavmaradék kapcsolódik; RLA polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy leucin-arginin aminosav-maradék kapcsolód ik; RN polipeptidek, amelyeklegalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy Asn-Thr-Val-Ser-Ser-szekvencia kapcsolódik. A CS-protein ismétlődő egységeket genetikailag kódoló szekvenciát ismert módon állít juk elő, például szintézissel; vagy, előnyösebben, P. falciparumból a m-RNS reverz transzkripciójával, például Ellis és munkatársai (Nature 302,536/1983/) módszerével; vagy a P. falciparum genom DNS-éből származó érintetlen gén közvetlen klónozásával, például Dame és munkatársai fent idézett módszere szerint. Az 1 .a ábra a CS-proteint kódoló régiót szemlélteti. AP. falciparumot és annak sporozoitjait fertőzött emberből vagy moszkitóból nyerhetjük. A CS-proteint vagy annak egy részét kódoló szekvencia klónozása után ismert módon előállíthatjuk annak egy al-fragmentumát, amely az ismétlődő egységet vagy annak egy részét kódolj a. A CS-protein génben levő megfelelő hozzáférhető restrikciós helyeket az la. ábrán szemléltetjük. Előnyösek az Xho II helyek. Az Xho II-veI végzett hasítással egy N-Asp-Pro -[(Asm-Ala-Asn-Pro) i s(Asn-Val- Asp-Pro) i ]n-C képletű, 16 ismétlődő egységet kódoló szekvencia válik szabadddá, a fenti képletben n értéke 1. Több tandem XHo II fragmentumot a megfelelő orientációban használva hosszabb ismétlődő egységeket kapunk, azaz a fenti képletben n értéke 1-nél nagyobb lesz. A szintetikus eljárások jól ismertek, és kereskedelmi forgalomban levő DNS-szintetizátorok alkalmazásával végrehajthatók. Szintézissel előállítható olyan oligonukleotid, amely lényegében a fenti aminosavaknak megfelelő kodonokat tartalmazza, és ugyanazon Xho II végeket vagy más hasítási helyeket tartalmaz a végeken. A fenti szintetikus oligonukleotidok eltérhetnek a természetes 64 kodontól, és vagy ugyanezen aminosavakat kódolhatják, vagy egy olyan polipeptidet, amelyben kis számú, előnyösen kb. nyolcnál kevesebb eltérő aminosav van, féltévé, hogy ezzel a polipeptid immunológiai védőképessége nem csökken jelentősen. A szintetikus kódoló szekvencia például a teljes működő szekvenciát kódolja, amelynek képlete (-Asn-Ala-Asn-Pro-)n, és n értéke legalább 16. 3 Apolipeptidet kódoló szekvenciát egy E. coli expressziós vektorba illeszthetjük, amelyek többsége ismert és hozzáférhető. A találmány szerinti polipeptidek magas szintű expressziója E. coliban meglepő, a termék szokatlan aminosav-összetétele - kb. 50% aszparagin, 25% alanin és 25% prolin - miatt. Mint azt alább ismertetjük, tapasztalataink szerint a kódoló szekvencia jól cxpresszálható a lambda PL promoteréből és a lambda dl riboszoma-kötőhelyéből álló regulátor elem használatával, amint azt a pASl plazmid tartalmazza (Rosenberg és munkatársai: Meth. Enzym. 101,123/1983/és Shatzman ésmunkatársai: Experimental Manipulation of Gene Expression, szerk. M. Inouye, Academic Press, New York, 1982).ApASl hordozza a replikáció pBR322 kezdetét, egy ampicillin-rezisztcncia markert, és a lambdából származó fragmentumoksorát, beleértve a PL-t, N-antiterminációs funkciójú felismerő helyeket (NutL és NutR), az rho-függő transzkripciós terminációs szignált (tRl) és a cD riboszoma-kötőhelyet, amely magában foglalja a cll transzlációt iniciálé helyet, amelynek G-maradékát közvetlenül egy Bam Hl hasítási hely követi. A pASl a pKC30cII-ből származtatható oly módon, hogy a pKC30cII cII-pBR322 csatlakozásánál levő Bam Hl hely és a cll ATG közötti nukleotidokat töröljük, és a molekulát újra összekapcsoljuk, hogy a Bam Hl helyet közvetlenül az ATG-től lefelé regeneráljuk. A pKC30cII-t úgy szerkeszthet jük meg, hogy a lambda 1,3 kb-ből álló Hae fragmentumát - amely a cll gént hordozza - a pKC30 Hpa I helyébe illesztjük, Rosenberg és munkatársai, illetve Shatzman és munkatársai fent idézett módszerei szerint. A pKC30-at Shimitake és munkatársai (Nature 292,128 /1981/) ismertették, ez egy pBR322 származék, amely a pBR322 tetR génjében a Hind m és Bam Hl helyek közé illesztve egy 2,4 kb-ból álló lambda Hind IIIBam Hl fragmentumot tartalmaz. A pASl-hez hasonló szerkezetet ismertettek Courtney és munkatársai (Nature 313,149/1985/) is. A pAS 1 az American Type Culture Collection-nél (Rockville,Maryland, Amerikai Egyesült Államok) van letétbe helyezve, ATCC 39262 számon. A találmány szerinti expressziós vektort úgy állítjuk elő, hogy a kódoló szekvenciát működőképes helyzetben - azaz helyes orientációban és megfelelő leolvasási rendben - ismert módszerrel egy E. coli expressziós vektor regulátor eleméhez kötjük. A fenti módon kifejeződött polipeptidet a szokásos fehérje-elválasztási módszerekkel választjuk el és tisztítjuk az azt termelő tenyészetből. A tisztítást például az alábbi lépésekből álló eljárással végezhetjük; 1) a sejteket clroncsoljuk, 2) a sejt-törmeléktől megtisztítjuk a rendszert, 3) a találmány szerinti eljárással előállított polipeptideket elválasztjuk a tisztított sejt-extraktumban levő egyéb polipeptidektől, 4) a maradék szennyeződést, így a maradék polipeptidet, szénhidrátot, nukleinsavat és/vagy lipopoliszacharidot egy befejező tisztítási művelettel eltávolítjuk. Az első lépést úgy hajthatjuk végre, hogy például lizozimet vagy más lizáló vagy pcrmeabilizáló szert adunk a rendszerhez, vagy a sejteket mechanikusan vagy ultrahangos kezeléssel roncsoljuk el. Az extraktum tisztítására szolgáló centrifugálás vagy ult4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
