201803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina hatóanyagát képező polipeptidek előállítására
HU 201803B A malária súlyos, széles körben elterjedt betegség, amely ellen - éveken át tartó erőfeszítések ellenére - még nem sikerűit vakcinát előállítani (Science, 226 679/1984/). Kísérletesen már sikerült emlősöket - beleértve az embert is - védetté tenni a malária kórokozója, a Plasmodium okozta fertőzések ellen, besugárzott sporozoitokkal végzett vakcinálással (Clyde és munkatársai: Am. J. Tropp. Med. Hyg. 24, 397 /1975/ és Rieckman és munkatársai: Bull. WHO 57(Supp. 1) 261119191). Yoshida és munkatársai (Science 207,71 /1980f) ismertették, hogy a fenti védettséget - legalábbis részben - a sporozoit felületén levő egyik proteinnel, a circumsporozoit (CS) proteinnel szembeni antitestek nediálják. A CS-proteinek ellen termelődött monoklonális antitestek in vitro semlegesítik a fertőzőképességet és in vivo védik az állatot. Úgy tűnik, hogy a CS-proteinek az egyes fajokon belül erősen megőrződnek az evolúció során, de különböző fajokban erősen eltérőek. Négy Plasmodium fajt ismerünk, amelyek az embert fertőzhetik. Ezek a P. falciparum, a P. vivax, a P. ovale és a P. malariae, az utóbbi kettő sokkal ritkábban fordul elő. A tudományos érdeklődés szempontjából fontosak még a P. berghei és a P. knowlesi, mivel ezen fajok gazdaszervezetei a rágcsálók, illetve a majmok. A P. knowlesi CS-proteinje egy 12 aminosavból álló szekvencia 12 egymás utáni ismétlődését tartalmazza. Zavala és munkatársai (J. Exp. Med. 157, 1947 /1983/) szerint az ismétlődő egység a fő immunogén a P. knowlesi CS-protinen, a fenti megállapítást azokra a kísérletekre alapozták, amelyek azt mutatták, hogy az ismétlődő egységek elleni antitestek blokkolják az anti-sporozoit antiszérum hozzáférhetőségét a szolubilizált sporozoit proteinhez. Gysin és munkatársa (J.Exp.Med. 160,935/1984/) megállapították, hogy a P. knowlesi CS-proteinjének egymás utáni ismétlődő egységeit képviselő szintetikus, 24 aminosavból álló peptid semlegesíti a virulens sporozoitok fertőzőképességét majmok esetén. Colman és munkatársai (W0 84-2922-A, nyüvánosságra kerülés: 1984.08.02.) ismertették a P. knowlesi CS-protein ismétlődő egységét kódoló régió egy részének klónozását és béta-laktamázzal és béta-galaktozidázzal fuzionálva annak annak kifejeződését. Nussenzweig és munkatársai (US 4 466 917) ismertették a P44 proteinnek nevezett sporozoit proteint, és annak klónozását és kifejeződését E. coliban. Enea és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 7520 /1984/) is találtak egy hasonló ismétlődő egység szerkezetet a P. cynomologi CS-proteinjében. Kemp és munkatársai (WO 84 02917-A) leírták a P. falciparum cDNS-ének klónozását és kifejeződését E. coliban. Dame és munkatársai (Science 225,593 /1984/) leírták a P. falciparum CS-proteinjének klónozását és kifejezését E. coliban. A protein eszerint közel 412 aminosavból áll, átlagos molekulatömege 44000, és egy tetrapeptid 41 egymás utáni ismétlődését foglalja magában. Az ismétlődő szakaszból származó szintetikus 7-, 11-és 15-tagúpeptid-töredékek kötődnek a CS-proteinnel szembeni monok-1 lonális antitestekhez. A találmány tárgya egyrészt eljárás a Plasmodium falciparum CS-protein ismétlődő egységét vagy annak egy részét kódoló szekvenciát tartalmazó E. coli expressziós vektor előállítására. A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti eljárással előállított expressziós vektorral transzfomált E. coli tenyészettel a P. falciparum CS-protein 16 vagy annál több egymás után ismétlődő egységét tartalmazó polipeptid előállítására és annak tisztítására az E. coli tenyészetből. Az 1 a. ábra a CS-proteint kódoló szekvenciát tartalmazó P. falciparum genom DNS egy régiójának részleges endonukleázos hasításával nyert géntérképe. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid az E. coliban termelődő 16 vagy több egymás után ismétlődő CS-protein egységet tartalmaz. Ez ugyan nem azonos a CS-proteinnel, de tartalmazhatja a CS-protein bizonyos, az ismétlődő egységtől eltérő részeit is. A. P. falciparum ismétlődő egysége egy tetrapeptid, amelynek szekvenciája az alábbi:-Asn-Ala-Asn-Pro-, a képletben Asn aszparagint, Alá alanint és Pro prolim jelent. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidben a fenti tetrapeptid variációi is előfordulhatnak, feltéve, hogy nem csökkentik jelentősen a velük szembeni antitestek reaktivitását a P. falciparum CS-proteinnel. Például Dame és munkatársai (Science 225,593 /1984/) vüágosan kifejtik, hogy a P. falciparum természetes CS-proteinjének 41 ismétlődő tetrapeptid egysége közül 37 szekvenciája Asn-Ala-Asn-Pro, míg 4 tetrapeptid szekvenciája Asn-Val-Asp-Pro - az utóbbi rövidítések közül Val jelentése valin és Asp jelentése aszparaginsav -. A polipeptid ismétlődő egységeinek előnyösen több, mint fele úgynevezett működő szekvenciának, azaz -Asn-Ala-Asa-Pro- szekvenciának felel meg. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid előnyösenkb. 16-112ismétlődő egységet tartalmaz. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid hibrid is lehet, vagyis nem-CS-protein ismétlődő egységet tartalmazó fúziós polipeptid. A fenti nem-CS-protein ismétlődő szekvencia hordozó molekulaként szolgálhat, az immunogén tulajdonságok fokozására, vagy a rekombináns mikroorganizmusban a klónozás és expresszió megkönnyítésére. Másik lehetőség, hogy a fenti kiegészítő szekvenciák más sporozoit-immunogénként, más Plasmodiumimmunogénként és/vagy más nem-Plasmodium-immunogénként szolgáló egy vagy több helyet hordoznak. A találmány csak azokra a CS-proteinekrenem vonatkozik, amelyek gyakorlatilag hasznosítható mennyiségben nem fejeződnek ki megbízhatóan E. coliban, és nem szükségesek a P. falciparum elleni immunizáláshoz. A találmány szerinti eljárással közelebbről az alábbi polipeptidek állíthatók elő: Rtet32 polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez a pBR322 tetraciklin-rezisztencia (tetR) génjéből származó kb. 32 N-terminális aminosav kapcsolódik; 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
