201802. lajstromszámú szabadalom • Hatóanyagként bacillus thuringiensis hibridsejteket tartalmazó peszticid készitmény és eljárás a hibridsejtek előállítására
HU 201802 B 3 4 átmérővel) szűrjük. Ezután a szűrőt Luria-közeg (a továbbiakban: LA) lemezre helyezzük (1 liter Luria-közeg 15 g agar-agart, 10 g triptont, 5 g élesztőkivonatot, 10 g nátrium-kloridot és 0,02 g ti midint tartalmaz vizes oldatban), és 16-24 órán át 37 °C 5 hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a szűrőt 0,5 ml folyékony LA-közegben (agar-agar nélkül) szuszpendáljuk, erélyesen homogenizáljuk, majd 10° és 10'1 hígításban olyan LA-lemezekre helyezzük, amelyek 50 pg/ml eritro- 10 micint és 5 (xg/ml tetraciklint tartalmaznak. így a nemkonjugált sejtek elkülönülnek. Az így kapott, eritromicinnel és tetraciklinnel szemben rezisztens konjugált sejteket olyan közegben helyezzük, amely a spóraképzést lehetővé teszi, 15 majd mikroszkóppal ellenőrizzük a delta-endotoxinok jelenlétét és jellegét: a hibrid törzsekben a sporangium felhasadása előtt a B. t. var. kurstaki törzsekre jellemző kettős piramis-alakú kristályt és egy B. t. varr. tenebrionis törzsekre jellemző hasáb- 20 (vagy kocka-) alakú kristályt tartalmaz. Ezeknek a kristályoknak a mérete megközelítőleg 2 pm, és a fáziskontrasztos mikroszkóppal könnyen kivehetők. Ennek megfelelően a hibridek vizuális azonosí- 25 tás útján könnyen elkülöníthetők. A hibridsejtekből álló tenyészetek (LA-lemezeken, 16 óra elmúltával, 30 eC hőmérsékleten) alaktani szempontból a B. t. tenebrionis tenyészetekkel azonosak, a kurstaki tenyészetektől azonban az alábbi jellegzetességek 30 alapján könnyen megkülönböztethetők: A tenyészetek Tenebrionis vagy Kurstaki hibridsejtek sejtek 35 alakja: szabálytalan körkörös domborzata: kiemelkedő domború széle: hullámos ép sima felülete: durva 40 A plazmidok a donortörzsből a befogadó törzsbe történő bevezetése fizikai úton is kimutatható a keletkezekett hibridsejtekből extrahált DNS aga- 45 róz-gélen végzett elektroforézissel. A DNS-molekulákat (plazmidokat) etidium-bromiddal való festés után UV-fénnyel besugrázva tesszük láthatóvá, és lefényképezzük [D. Lereclus és munkatársai: Mol. Gen. Genet. 191,307 (1983)]. A találmány szerinti eljárással előállított legtöbb hibridsejt - többek között - tartalmazza a befogadó B. t. tenebrionis törzsből származó, jellemző 10 megadaltonos plazmidot és a B. t. kurstaki donortörzsre jellemző 5,6 megadaltonos plazmidot. A B. t. kurstaki és B. t. tenebrionis delta-endotoxinját kódoló gént tartalmazó plazmidok molekulatömege megközelítőleg azonos, s ennek következtében a hibridtörzs plazmidogramjában csak nehezen különböztethető meg. A találmány szerinti eljárással előállított B. t. hibridek hasznos inszekticid sajátságokkal rendelkeznek: mind a B. t. kurstaki törzsekkel, mind a B. t. tenebrionis törzsekkel szemben érzékeny kártevők ellen hatásosak. Általában a hibridsejtek inszekticid sajátságai az inszekticid hatékonyság vagy a hatásspektrum vagy mindkettőnek a szempontjából előnyösebbek, mint a konjugáló anyatörzsek fizikai keverékének az inszekticid tulajdonságai. A találmány szerinti eljárással előállított B. t. hibridsejtek meglepő peszticid sajátságait a Trichoplustis ni (káposztahernyó), Spodoptera littoralis (egyiptomi gyapotlevélféreg) és a Phaedon cochleariae (mustárbogár) lárváival szemben mutatott hatásukkal igazoltuk az alábbi biológiai vizsgálattal: A hatás biológiai mérése 108 spóra/ml koncentrációjú vizes szuszpenziót mikroszórópisztoly segítségével közepes méretű kínai káposztalevélre permetezünk a lecsepegtetés kezdetéig. A permetezésssel rávitt bevonat megszáradása után minden egyes levelet nedves szűrőpapírra helyezünk egy 9 cm átmérőjű műanyag petricsészében. Ezután minden egyes csészébe 10 (második fázisú lárvaállapotban levő) rovart helyezünk; minden egyes rovarfajtához 3 csészét alkalmazunk. A mérést 25 °C hőmérsékleten, klimatizált kamrában, 65% viszonylagos páratartalom mellett, 16 órás megvilágítási periódussal végezzük. E körülmények között a lárvákat öt napon át a kezelt levelekkel etetjük, majd megállapítjuk a lárvák pusztulását, és azt százalékos értékben fejezzük ki. Eredményeiket az alábbi táblázatban foglaljuk össze. A pusztulás százalékos értéke 5 nap után B. t. hibridtörzs Spodotera Trichoplusia Phaedon L21001 87 100 100 L21004 90 100 100 L21016 97 100 100 L21017 97 100 100 L21019(1) 93 100 100 Kurstaki HD73(1) 3 100 0 Tenebrionis^ 0 0 100 ”k + t” tankkeverék(3> 0 100 43 3
