201800. lajstromszámú szabadalom • Eljárás t-PA és SCU-PA termelésének növelésére

HU 201800 B

Ezekhez a tanulmányokhoz a tenyészeteket összefolyásig növesztjük 24 üreges szövettenyésztő lemezeken, 10% borjúembrió szérummal és gentamicinnel kiegészített RPMI-1640-et alkalmazva.

Az összefolyáskor a szérum-tartalmú tápközeget 5 eltávolítjuk az üregekből és a sejteket kétszer vagy háromszor mossuk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal. RPMI-1640 tápközeget adalékokkal (azaz heparinnal, ECGF-fel, vagy heparin/ECGF- fel) vagy adalékanyagok nélkül adunk az üregekhez 10

(1 ml/üreg) és adott időpontokban alikvotokat veszünk ki a vizsgálatokhoz. Négyszeres párhuzamosban készült üregekből az alikvotokat összegyűjtjük és Tween-80-at adunk hozzá 0,01% végső koncentrációban. A mintákat 4 °C hőmérsékleten tároljuk 15

7

a mérési eljárásig. A t-PA-t standard ELISA vizsgálati készletet alkalmazva mérjük, a készlet az American Diagnostica-tól (Greenwich, Connaecticut) szerezzük be. Az SCU-PA-hoz az ELISA vizsgálatot a fentebb leírtak szerint fejlesztjük ki.

Az alábbi IIA. és II.B. táblázatokban a t-PA termelését ki nem egészített tápközeggel, egyedül ECGF-fel kiegészített tápközeggel, egyedül heparinnal kiegészített tápközeggel, és EGCF/heparinnal kiegészített tápközeggel mérjük - ECGF és heparin változó koncentrációinál. A IIA és ÜB táblázatokban bemutatott tanulmányokat azonos módon hajtjuk végre, mint ahogy ezt az I. Táblázattal kapcsolatban leírtuk. WI-38 (TC 25) humán diploid fibroblaszt sejteket alkalmazunk.

8

IIA TÁBLÁZAT

t-PA termelése ECGF-fel, heparinnal, és ECGF/heparinnal különböző koncentrációknál

Tápközeg

7

16

25

Idő (óra)

30

t-PA (ng/üreg)

42

50

62

1ARPMI

5

9

11

15

19

17

19

2.5 (xg ECGF

7

23

29

32

36

32

32

3.10 (xg ECGF

7

36

51

67

77

75

79

4.25 |xg ECGF

10

42

50

73

77

80

78

5.50 jxg ECGF

12

38

58

85

94

92

103

6.100 (x ECGF

11

43

64

93

113

115

121

7.200 (xg ECGF

13

54

83

116

145

152

163

8.5 jxg ECGF

13

51

85

140

194

217

243

+ 90 |xg Hepo

9.10 ug ECGF

12

55

86

131

171

184

239

+ 90 ixgHep

10.25 ixg ECGF

14

68

195

141

207

222

300

+ 90 (xg Hep

11.50 ixg ECGF

12

83

107

150

194

229

307

+ 90 (xg Hep

12.100 ixg ECGF

15

65

107

148

196

241

350

+ 90 (xg Hep

13.200 ixg ECGF

20

76

128

175

258

305

421

+ 90 [xg Hep

IIB TÁBLÁZAT

t-PA termelése ECGF-fel, heparinnal, és ECGF/heparinnal különböző koncentrációknál

Tápközeg

7

16

25

Idő (órák) 30

t-PA (ng/üreg)

42

50

62

IB. RPMI

5

8

1

10

9

15

18

14.5p.g Hep

5

7

12

12

19

23

28

15.15 (xg Hep

4

8

7

7

9

20

19

16.30 p,g Hep

6

7

11

9

12

14

15

17.90 jxg Hep

6

8

10

10

11

20

20

18.180 jxg Hep

7

8

20

14

16

17

28

19.5 ug Hep

8

36

59

90

118

165

231

+ 50 (xg ECGF

20.15 ug Hep

9

47

86

101

141

174

241

+ 50 (xg ECGF

21.30 ug Hep

8

54

71

84

141

171

241

+ 50 (xg ECGF

22.90 ug Hep

10

51

98

120

171

203

283

+ 50 (xg ECGF

5