201800. lajstromszámú szabadalom • Eljárás t-PA és SCU-PA termelésének növelésére
HU 201800 B A találmány tárgya eljárás t-PA (szöveti plazminogén aktivátor) és SCU-PA (egyetlen láncú urokinázplazminogén aktivátor normál humán diploid tüdő fibroplaszt sejtek általi termelésének növelésére szérum-mentes tápközegben. A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy a tenyészethez 5 p.g/ml - 220 p,g/ml mennyiségben heparint vagy kis molekulatömegű heparin és 5 pg/ml - 220 p.g/ml mennyiségben valamely endotéliális sejtnövesztő faktort adunk. A plazminogén-aktivátorok (PA) szerint proteázok tripszinszerű fajlagossággal, amelyek átalakítják a plazminogén proenzimet plazmin enzimmé. A plazmin viszont a fibrinolizis elsődleges szere a véráramban, ahol az egy vérrög fibrin-hálózatát lebontja, oldható termékeket képezve. A két ismert elsődleges (primér) humán plazminogén aktivátor a szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) és az egyetlen láncú urokináz plazminogén aktivátor (SCUPA), ez utóbbi az urokináz (UK) proenzimje. A t-PA-t, amely 63-65 K fehérje, számos emlős endotéliális sejt kiválasztja, beleértve az aortás és vénás endotéliális sejteket. A t-PA nagy affinitással bír a fíbrinhez. Ebből az okból kifolyólag a t-PA-ról úgy gondoljuk, hogy közvetlenül a vérrög helyén keletkezik és hat. Az SCU-PA-ról amely 55 K egyetlen láncú fehérje, viszont úgy véljük, hogy a vérrög helyére a véráram útján érkezik. A t-PA és SCU-PA, az UK és a sztreptokináz (SK, egy harmadik plazminogén aktivátor), valamint ezek módosulatai, intenzív tanulmányok tárgyai, hogy meghatározzák megfelelő fiziológiai szerepüket a trombolizisben, angiogenezisben, metasztázisban, gyulladásokban és peteérésben. Az ilyen tanulmányok magukban foglalják ezen anyagok alkalmazásának klinikai taunlmányait trombózis kezelésére. Ezek a vizsgálatok ezenkívül magukban foglalják ezen enzimek nagyobb mennyiségű előállításának eszközeire irányuló kutatásokat normál humán sejtekből, hogy ezeket az enzimeket trombolitikus szerként alkalmazhassuk. Ezen kívül maguknak az enzimeknek ilyen emelt szintű termelése magával vonja a megfelelő hírvivő RNS-ek (mRNS) emelt szintjeit is. Az mRNS-ek megnövekedett szintjének létrejötte viszont rekombináns DNS előállítási módszerekkel növeli az enzimek vagy módosulataik termelését. A plazminogén aktivátorokra, főleg a t-Pa-ra, UK-ra és SCU-PA-ra vonatkozóan nem régi öszszefoglaló olvasható az alábbi irodalmi helyen: Cedorholm-Williams S.A.: „Molecular Biology of Plasminogen Activators and Recombinant DNA Progress” (A plazminogén aktivátorok molekuláris biológiája, és a rekombináns DNS folyamat); Bio Eassyas, 1,168-713 (1984). Jelenleg a t-PA fő nem rekombináns) forrásai nagy mennyiségben a Bowes melanóm sejtek. Ezek a rosszindulatú sejtek megfelelő mennyiségű t-PA-t termelnek az enzim tisztításához és jellemzéséhez, és monoklonális és poliklonális antitestek előállításához. Ezen kívül ezek megfelelően fajlagos hírvivő RNS-t (mRNS) termelnek, hogy lehetővé váljék a teljes gén-klónozás. A t-PA-nak és hírvivő RNS- ének forrását azonban keresik normál (azaz nem rosszindulatú) sejtekből. Olyan forrás szükséges, 1 amely nagy mennyiségű t-PA-t termel szérum-mentes tápközegből, ez lehetővé teszi jelentős mennyiségű mRNS izolálását a sejtekből. A szérum jelenléte nagy mértékben hat a t-PA termelésre és kinyerésre a t-PA inhibitor és egy sor, szérumban található fehérje jelenléte miatt. Nemrégiben számolt be két folyóiratcikk PA termeléséről normál humán sejtekből. ELőször Kadouri A. és Bohak Z. (’’Production of Plasminogen Activator in Cultures of Normal Fibromasts” (Plazmingén aktivátor előállítása normál fibrolasztok tenyészeteiben) Biotechnology, 35-358 /1983. június/) adnak hírt plazminogén aktivátor (PA) előállításáról tüdőfibroblasztok számos különböző törzséből. Ők a PA előállítását elsősorban az IMR-90 humán diploid fibroblasztból tanulmányozták különböző szérumokkal és poli-D-lizinnel burkolt tenyésztő lemezekkel. Két kísérletről számolnak be, amelyben egyik szérumos tápközeget használnak először, ezután pedig a tépközeget 0,5% laktalbumin-hidrolizátummal kiegészített szárum-mentes tápközegre cserélik ki néhány napos termelésre (lásd a közelményben az 1(B) és 2(B) ábrákat a 356. oldalon). Egy szakaszos és egy folyamatos eljárást is tanulmányoztak, de az ezekben a kísérletekhez alkalmazott tápközeg mibenléte nem volt egyértelműen azonosítható. A szerzők nem ismerik fel, hogy itt két különböző PA-ról van szó, amelyeket a sejtek termelnek. A másik közleményben (Gerard C. Brouty-Boye és munkatársai: „Biosynthesis of Human Tissue- Type Plasminogen Activator by Normal Cells (Humán szöveti típusú aktivátor bioszintézise normál sejtek révén), Biotechnology, 1058-1062,1984. December) a szerzők beszámolnak t-PA előállításáról humán embrió tüdő (HEL) sejtekben szérum-mentes tápközegben. Nyolc különböző induktor alkalmazását tanulmányozták t-PA termelésének stimulálására ezekből a sejtekből. Ezek a lehetséges induktorok a következők voltak: kalcitonin (lazac), kolera toxin, kolhicin, konkavalin A. glicin, glicilglicin, heparin, laktalbumin, nátrium-butirát, cttrombin, és ultraibolya fény. Ezek közül a konkavalin A jelentősen (négyszeresére növelte a termelést az induktor nélküli állapothoz viszonyítva. A szerzők azt is megjegyzik, hogy szinergikus hatás a konkavalin A és többi vizsgált vegyület között nem volt érzékelhető. A jelen találmány heparin és endotéliális sejtnöveszthető faktor (ECGF) kombinációjának alkalmazását tartalmazza abból a célból, hogy növelje a normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejtek által szérummentes tápközegben termelt t-PA és SCUPA mennyiségét. A EGCF szarvasmarha hipotalamuszból vagy hipofízisből származó extraktum, amely stimulálja a szarvasmarha és humán vénás és aortás endotéliális sejtek növekedését (lásd Maciag T. és munkatársai: Proceeding of the National Academy of Science, 76,5674-78 (1979); és Olander J. és munkatársai: In Vitro, 16,209 /1980/). Az ECGF kereskedelmi forgalomban kapható. A heparinról leírták, hogy 90 pg/ml koncentrációban fokozza az ECGF stimulátor hatását humán köldök vénás endotéliális sejtek (HUVE) burjánzására és felnőtt emberi véredényekből származó endotéliális sejtek 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
