201800. lajstromszámú szabadalom • Eljárás t-PA és SCU-PA termelésének növelésére
HU 201800 B burjánzására. Nincsen arra utalás, hogy ezek a szerek stimulálnak a PA termelést ezekben a sejtekben (lásd Thornton S.C. és munkatársai: Science, 222, 623 /1983/). Ebben a tanulmányban a tápközeg 20 százalék boíjúembrió-szérummal van kiegészítve. Maciag T. és munkatársai (Science, 225, 932-5 /1984/) továbbá arról számolnak be, hogy a heparinnak erős kötő aktivitása van ECGF-hez, amely az ECGF heparin-Sepharose kromatográfiás kivonásának alkalmazásában is megmutatkozik. A jelen találmány abban különbözik a fentiektől, hogy az ECGF és a heparin kombinációjáról úgy találtuk, hogyjelentősen növeli a normál humán tüdő fibroblaszt tenyészetek által szérummentes tápközegben termelt t-PA és SCU-PA mennyiségét. Amint alább leírjuk, más endoteliális sejt polipeptid autogéneket is lehet alkalmazni ebben a találmányban endoteliális sejtnövesztő faktorként, így ezután az ECGF kifejezést úgy alkalmazzuk, hogy azokat az endoteliális sejtnövesztő faktorokat ölelje fel, amelyeket szarvasmara hipofízisből vagy hipotalamuszból izolálhatunk. Az „endoteliális sejtnövesztő faktor” kifejezés viszont, amint ezt a továbbiakban alkalmazzuk, a többi endoteliális sjet polipeptid autogéneket foglalja magában. A jelen találmány eljárást nyújt szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) és egyetlen láncú urokináz plazminogén aktivátor (SCU-PA) termelésének növelésére normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetekben szérummentes tápközegben, az eljárás abból áll, hogy a fenti tenyészethez heparint vagy kis molckulatömegű heparint és endoteliális sejtnövesztő faktort adunk. A standard (nem tisztított), kereskedelmi forgalomban levő ECGF-re számolva az ECGF-et a szérum-mentes tenyésztő tápközeghez 5 pg/ml-220 pg/ml koncentrációban, és a heparint vagy kis molekulatömegű heparint 5 pg/ml - 220 pg/ml koncentrációban adjuk. Az ilyen standard ECGF-re vonatkoztatva a heparin vagy kis molekulatömegű heparin előnyös koncentrációja 25 pg/ml és 150 pg/ml között, és az ECGF előnyös koncentrációja 25 pg/ml és 100 pg/ml között van. A heparin vagy kis molekulatömegű heparin még előnyösebb koncentrációja 30 pg/ml és 100 pg/ml között van, és az ECGF még előnyösebb koncentrációja 25 pg/ml és 60 pg/ml között van. Ezen kívül amikor az ECGF koncentrációja 15 pg/ml alatt van, akkor 30 pg/ml heparin-koncentráció vagy több az előnyös. Hasonlóképpen, amikor az alkalmazott heparin koncentrációja 15 pg/ml alatt van, akkor 25 pg/ml ECGF koncentráció vagy több az előnyös. A heparin (standard molekulatömegű) az előnyös a kis molekulatömegű heparinnal szemben. Bár bármilyen normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejtet lehet alkalmazni a t-PA és SCU-PA termelésére a jelen találmány eljárása szerint, az előnyös törzsek a WI-38, MCR- 5, IMR-90 és IMR-91. A legelőnyösebb a WI-38 tüdő fibroblaszt sejt törzs. A találmány továbbá eljárást nyújt szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) termelésének növelésére normál diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetekben, amely abban áll, hogy a tenyészethez heparint vagy kis molekulatömegű heparint és enditeliális sejtnövesztő faktort adunk. A standard (nem tisztí3 tott), kereskedelmi forgalomban levő ECGF-re számolva az ECGF-et a szérummentes tenyésztő tápközeghez 5 pg/ml - 220 pg/ml koncentrációban, és a heparint vagy kis molekulatömegű heparint 5 pg/ml - 220 mcg/ml koncentrációban adjuk. A heparin vagy kis molekulatömegű heparing és az ECGF különböző előnyös koncentrációi a fentebb már leírtakéval azonosak a találmánynak ebben az alkalmazásában is. A heparin az előnyös a találmánynak ebben az alkalmazásában is. Az előnyös és legelőnyösebb tüdő fibroblaszt sejttenyészet törzsek a t-PA előállításához ugyanazok, amelyeket a mind t-PA, mind az SCU-PA előállítását egyaránt célzó fentebb leírt, találmányunk szerinti eljárásnál előnyösnek írtunk le. A találmány továbbá eljárást nyújt egyetlen láncú urokináz plazminogén aktivátor (SCU-PA) termelésének növelésére normál humán diploid tüdő fibroblaszt sejttenyészetekben, amely abban áll, hogy a tenyészethez heparint vagy kis molekulatömegű heparint és endotéliális sejtnövesztő faktort adunk. A standard (nem tiszított), kereskedelmi forgalomban levő ECGF-re számolva az ECGF-et a szérummentes tenyésztő tápközeghez 5 pg/ml - 220 pg/ml koncentrációban, és a heparint vagy kis molekulatömegű heparint 5 pg/ml - 220 pg/ml koncentrációban adjuk. A heparin vagy a Ids molekulatömegű heparin és az ECGF különböző előnyös koncentrációi a fentebb már leírtakéval azonosak a találmánynak ebben az alkalmazásában is. A heparing az előnyös a találmánynak ebben az alkalmazásában is. Az előnyös és legelőnyösebb tüdő fibroblaszt sejttenyészet törzsek az SCU-PA előállításához ugyanazok, amelyeket a mind a t-PA, mind az ACU-PA előállítását egyaránt célzó fentebb leírt, találmányunk szerinti eljárásnál előnyösnek írtunk le. Mind az endotéliális sejtnöveszto faktor (ECGF), mind a heparing kereskedelmi forgalomban kapható. A találmány gyakorlati megvalósításában alkalmazott standard ECGF egyik forrása a Collaborative Research, Inc., Lexington, Massachusets. AZ ő ECGF-jük (amelyet „endotéliális sejtnövesztő kiegészítődnek, vagy „CR-ECGS”nek neveznek) szarvasmarha hipotalamuszból készül. A standard ECGF másik forrása a Seragen, Inc., Boston, Massachussets, akik az anyagot szarvasmarha hipofízisből készítik. Az alábbi I-V. Táblázatok a találmány szerinti eljárást t-PA és SCUPA termeléséhez standard ECGF-et alkalmazva mutatják be. A heparin megbízható kereskedelmi forrásaként számos hely szóba jöhet. A „kis molekulatömegű heparin”, ahogy itt használjuk, depolimerizált heparint jelent, amelynek átlagos molekulatömege 15000-nél kevesebb. A jelen találmány gyakorlati kivitelezésében alkalmazott kis molekulatömegű heparint a 4,281,108 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás íija le; ennek átlagos molekulatömege mintegy 5000. A fentebb leírt endotéliális sejtnövesztő faktoron (ECGF és p-ECGF) kívül, amelyeket szarvasmarha hipotalamuszból és szarvasmarha hipofízisből izoláltak, más endotéliális sejtnövesztő faktorokat is izoláltak és jellemeztek. így létezik az endotéliális sejt polipeptid autogéneknek egy családja, 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
