201799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejttenyésztési eljárásokhoz alkalmas mikrohordozó előállítására
HU 201799 B 9 10 Aminosavak mg/1 mg/1 L-glutaminsav-H20 150,0 L-prolin 40,0 L-glutamin 100,0 DL-szerin 50,0 glicin 50,0 DL-treonin 60,0 L-hisztidin-HCl 20,0 DL-triptofán 20,0 L-hidroxi-prolin 10,0 L-tirozin 40,0 DL-valin 50,0 Vitaminok mg/1 mg/1 aszkorbinsav 0,050 niacin 0,025 d-biotin 0,010 niacin-amid 0,025 kalciferol 0,100 n-amino-benzoesav 0,050 Ca-pantotenát 0,010 piridoxál-HCl 0,025 kolin-klorid 0,500 piridoxin-HCI 0,025 folsav 0,010 roboflavin 0,010 i-inozit 0,050 tiamin-HCl 0,010 menadion 0,010 vitamin A (acetát) 0,14 Szervetlen sók mg/1 mf/1 CaCl2 (vízmentes) 140,0 NaCl 8000,0 NaHC03 350,0 Fe(N03)3 0,1 NaH2P04.H2-KC1 400,0 kh2 po4 60,0 Na2HP04.2H20 60,0 MgS04.7H20 200,0 Az előállított szuszpenziót egy alkalmas keverő, 35 rázógép 250 ml-es lombikjába töltjük. A mikrohordozó szuszpenizójához 50 ml, a fenti összetételű tápoldatban szuszpendált primer, 9 napos csirkeembrió sejteket adunk és a lombik tartalmát a tápoldattal 100 ml-re egészítjük ki. így a sejtek inoku- 40 lációs koncentrációja 0,5 millió sejt/ml és a mikrohordozó koncentrációja 50 cm2/ml tenyészfelületet biztosít. A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten és a mikrohordozó szuszpenziójának enyhe keverése mellett 45 végezzük. A keverés intenzitása a tenyésztés első napján 10 fordulat/perc, a másik és harmadik napont 20 fordulat/perc, a továbbiakban pedig 50-60 fordulat/perc. A tenyésztés második napjától kezdődően a tápoldat egy részét naponta kicseréljük, 50 a második és harmadük napont a tápoldat 50%-át, a továbbiakban a tápoldat 70%-át. A tenyésztés kezdetétől eltelt 6-6. napon a mikrohordozó részecskéin primer csirkeembrió sejtek tenyészete kifejlődik. A tenyészet sűrűsége a tenyésztés végére 55 (a 6. napon) eléri az 5,8 ± 0,3 millió sejt/ml sűrűséget, azaz a primer csirkeembrió sejtek száma 11-szeresre növekszik. A mikrohordozón kifejlődött sejtek számának meghatározását a következő módszer szerint végezzük. A tenyésztés befejezése 60 után 10 ml térfogatú mintát veszünk (előzőleg a mikrohordozót gondosan eloszlatjuk a teljes térfogatban). A mintában kiülepítjük a mikrohordozót és leöntjük a rajta levő folyadékot, majd mikrohordozón levő tenyészetet 0,15 mól-os foszfát-puffer 65 oldattal többször kimossuk. 12. példa A 2. példában leírt mikrohordozót alkalmazzuk zöldmajmok szekunder vesesejtjeinek tenyésztésére. A zöldmajmok szekunder vesesejtjeinek koncentrációja a mikrohordozót tartalmazó szuszpenzióban 2.105 sejt/ml, a mikrohordozó konzisztens maradékánál 5,5 ml-t mérünk be 100 ml tápoldatba, ez a bemérés 15 cm2/ml tenyésztési felületet biztosít. A felhasznált tápoldat összetétele: maximális Eagle-tápoldat 10% borjúszérummal, 0,25% laktalbumin-hidrolizátum, 0,1% galaktóz, 20 mmól HEPES-puffer oldat és antibiotikum. A mikrohordozó és a sejtek tápoldatos szuszpenziójából 350 ml-t mérünk be egy 1 literes tenyésztő lombikba. A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten és a mikrohordozó szuszpenziójának enyhe keverése mellett végezzük. A keverés intenzitása a tenyésztés első napján 10 fordulat/perc, a második és harmadik napon 20 fordulat/perc, a továbbiakban pedig 50- 60 fordulat/perc. A tenyésztés 72. órjában a tápoldat 30%-át, a 120. órában pedig a tápoldat 70%-át cseréljük ki friss tápoldatra. A tenyésztés 6. napján a mikrohordozó majdnem mindegyik részecskéjén sűrű sejttenyészetet figyelhetünk meg. Ebben az időpontban a sejtek koncentrációja eléri a 3,8 millió sejt/ml értéket. 13. példa A 2. példában leírt mikrohordozó alkalmazásá-6
