201799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejttenyésztési eljárásokhoz alkalmas mikrohordozó előállítására
HU 201799 B val vizsgáljuk a sejtek mikrohordozón történő hosszúidejű tenyésztését. Zöldmajmok szekunder vesesejtjeit tenyésztjük a 12. példában leírtakkal teljesen azonos módon. A sűrű tenyészet kifejlődése után a mikrohordozót 0,51-es forgó lombikba visszük át. Ezt megelőzően a lombikok belső falát szilikonvegyülettel vonjuk be. Minden lombikba 175 ml kifejlődött sejttenyésztet tartalmazó mikrohordozó szuszpenziót teszünk. A tenyésztést 37 #C hőmérsékleten, 10 fordulat/perc keverési intenzitással végezzük. A tápoldat összetétele hasonló a 12. példában leírt tápoldatéhoz, de a szérum koncentrációja csak 3%. Hetente kétszer cseréljük a tápoldat 50%-át friss tápoldatra. Minden hétem meghatározzuk a sejtek számát a 11. példában leírt módszerrel és a mikrohordozón levő tenyészet kivett mintájának mikroszkópos vizsgálatával. A megfigyelések azt mutatják, hogy a sejtek kilenc héten át (megfigyelési időtartam) transzparensek maradtak, erős kontúrjukat és tipikus alakjukat megtartották és a mikrohordozóról látható módon nem váltak le. A megfigyelés teljes időtartama alatt a sejtek száma 3,6 ± 0,36 millió sejt/ml értéken maradt. 14. példa Egy átoltási vonal sejtjeit a 12. példában leírtak szerint előállított mikrohordozón, szokásos és csökkentett koncentrációjú szérumot tartalmazó tápoldatban tenyésztjük. A mikrohordozó konzisztens maradékából 5,5 ml-t mérünk be 100 ml tápoldatba, ez a bemérés 15 cm2/ml tenyésztési felületet biztosít. A 4647-es vonal egészséges, felnőtt zöldmajmok veséjéből nyert sejtjeit tenyésztjük, a sejtek inokulációs koncentrációja 15.Hr sejt/ml. A 12. példában megadott összetételű tápoldatot alkalmazzuk, de az egyik esetben 10/ borjúszérummal, a másik esetben viszont 1% borjúszérummal. Mindkét esetben adunk még a tápoldathoz nátrium-piruvátot (olyan mennyiségben, hogy a végkoncentrációja 10 mmól legyen) és metil-cellulózt (olyan mennyiségben, hogy a végkoncentrációja 0,3% legyen). Összehasonlításul ugyanezt a sejtkultúrát 0,1 literes síkfenekű üveglombik felületén is tenyésztjük, a sejtkultúra inokulációs sűrűsége az üveglombikban ugyanaz, mint mikrohordozón tenyésztett kultúráé, ez jelen esetben 10.103sejt/ml koncentrációt jelent. A szokásos és csökkentett szérumkoncentrációjú tápoldatban, a szokásos eljárással (üvegfelületen) és mikrohordozón történő sejttenyésztésnél a 10% szérumot tartalmazó tápoldat esetében az üvegfelületen tenyésztett sejtek száma egyébként azonos körülmények között 80,2%, az 1% szérumot tartalmazó tápoldat esetében pedig a mikrohordozón tenyésztett sejtek száma 42,2%. 15. példa Egy diploid vonal sejtjeit az 1. példában leírtak szerint előállított mikrohordozón tenyésztjük. Az M-21 vonal humán embrió szövetből nyert diploid sejtjeit a 12. példában leírthoz hasonló mikrohordozón tenyésztjük, a sejtek inokulációs koncentrációja jelen esetben 3.105 sejt/ml. A tenyésztés negyedik napján a sejtek száma eléri a 1,8 millió sejt/ml értéket, azaz számuk 96 óra alatt 6-szoros 11 lesz, és emellett a mikrohordozó részecskéinek nagy hányada sejtréteggel borítottá válik. 16. példa A találmány szerinti mikrohordozón tenyésztett sejtek kinyerése. Primer csirkeembrió sejteket a 11. példában leírtak szerint tenyésztünk. A tenyésztés befejezése után 10 ml mintát veszünk (előzőleg a mikrohordozót gondosan eloszlatjuk, hogy egyenletes eloszlású szuszpenzióból vegyük a mintát), és a 11. példában leírtak szerint meghatározzuk a sejtek számát. A sejtszám meghatározása 5,7 millió sejt/ml mértéket ad. A mikrohordozó fő tömegét ezután kimossuk és 50 ml 0,25%-tripszint és 0,02% etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó 0,15 mól-os foszfát-puffer-oldatban újra szuszpendáljuk. 5 perc múlva a kiülepedett mikrohordozóról az oldatot óvatosan leöntjük és a visszamaradó szuszpendáló oldatban óvatosan leöntjük és a visszamaradó szuszpendáló oldatban levő mikrohordozót 5 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 0,5% laktalbumin-hidrolizátumot tartalmazó foszfát-puffer oldatot adunk a mikrohordozó szuszpenzióhoz és többször felrázzuk a lombikot. A mikrohordozóról szemmel láthatóan levált sejtek számát meghatározzuk. A sejtek száma így 5,25 millió sejt/ml értékű, azaz a kitermelés kb. 92%-os a sejtmagok számlálása alapján. A találmány ipari alkalmazhatósága: A találmány a gyógyászatban, az állatgyógyászatban, vírusvakcinák és különböző biológiailag aktív hatóanyagok, például nagy aktivitású interferon készítmények, hormonok, enzimek és más specifikus termékek előállításánál alkalmazható. 12 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás sejttenyésztésre alkalmas mikrohordozó előállítására, amelyben a mikrohordozó részecskét térhálósító-szerrel kezelt zselatinból alakítjuk ki és a végterméket stabilizáljuk, azzal jellemezve, hogy a zselatin részecskék kialakításához zselatin oldatot térhálósító-szerrel kezelünk, a keletkező zselatin blokkpolimert szabálytalan alakú részecskékké aprítjuk és a 75-350 pm méretű részecskéket leválasztjuk, vagy száraz zselatint szabálytalan alakú részecskékké aprítunk, a 75- 350 pm méretű részecskéket leválasztjuk és ezeket kezeljük térhálósító-szerrel, majd a mikrohordozó részecskéket kialakulásuk után, stabilizálásukat megelőzően, a felületük lesimítása érdekében proteolitikus enzimmel kezeljük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy térhálósító-szerként dialdehideket, illetve formaldehideket alkalmazunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti ejárás, azzal jellemezve, hogy dialdehid térhálósító-szer alkalmazásakor a kialakított részecskék stabilizálását ismételt dialdehides és ezt követően redukáló reagenssel történő kezeléssel végezzük. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy redukáló reagensként alkáli-fémek bórhid-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
