201799. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejttenyésztési eljárásokhoz alkalmas mikrohordozó előállítására
HU 201799 B 7 8 120 °C hőmérsékleten, autoklávban 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 510 g szabálytalan alakú, 1,07 g/cm3 sűrűségű, 160-200 p,m részecskeméretű mikrohordozót kapunk. A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz ha- 5 sonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg. 9. példa 400 ml 50 °C hőmérsékleten előállított, 25%-os 10 vizes zselatin oldatot intenzíven összekeverünk 100 ml 35%-os vizes formaldehid oldattal. A keletkezett zselatin blokkpolimert 200 p.m-es szitán átsajtoljuk. Az így kapott 200 pm-nél kisebb méretű részecskéket 0,15 mól-os, pH = 7,6 értékű foszfát- 15 puffer oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal szobahőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. Ezután a részecskéket a tripszin eltávolítása érdekében 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk. A kimosott részecskékhez 100 ml 35%-os formaldehid 20 oldatot adunk és szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A formaldehid oldatot szűréssel eltávolítjuk, a mikrohordozót 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk és a 0,15 mól-os NaCl-oldatban szuszpendált mikrohordozót 120 °C hőmérsékleten, autoklávban 25 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 500 g szabálytalan alakú, 1,09 g/cm3 sűrűségű 150-200 p,m részecskenagyságú mikrohordozót kapunk. A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák 30 eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg. 10. példa 200 g aprított és szitált, 40-50 p.m száraz részecskeméretű száraz zselatint vízben való duzzasztás után 500 ml 25%-os glutáraldehid oldattal kezelünk. A glutáraldehid feleslegét vízzel kimossuk és a zselatin blokkpolimer részecskéket 0,15 mól-os, pH = 7,6 értékű foszfát-puffer oldattal készített 0,25%-os tripszin oldattal szobahőmérsékleten, állandóan keverve kezeljük. Ezután a részecskéket desztillált (ionmentesített) vízzel mossuk a tripszin és a zselatin fermentáció hasításánál keletkezett oldható termékek eltávolítása érdekében. A kimosott részecskékhez 100 ml 25%-os glutáraldehid oldatot adunk és szobahőmérsékleten állni hagyjuk a rendszert. Ezután a glutáraldehid oldatot eltávolítjuk és a részecskéket vízzel kimossuk, majd 1 liter 1%-os nátrium-hidrogén-szulfit oldatban szuszpendáljuk és 30 percig állni hagyjuk. Ezt követően a mikrohorodozót 0,15 mól-os NaCl-oldattal kimossuk. A 0,15 mól-os NaCl-oldatban szuszpendált mikrohorodozót 120 °C hőmérsékleten autoklávban, 15 percig sterilizáljuk. Az eljárással 500 g szabálytalan alakú, 1,07 g/cm3 sűrűségű, 80-120 |im részecskenagyságú mikrohordozót kapunk. A mikrohordozót az 1. példában leírtakhoz hasonlóan vizsgáljuk és az eredményt az 1-10. példák eredményeit összefoglaló táblázatban adjuk meg. Az 1-10. példákban leírt mikrohordozók vizsgálati eredményei A mikrohordozó fajtája Kiindulási sejtkoncentráció (sejt/ml) Tenyésztett sejtkoncentráció (sejt/ml) Szaporodási tényez 1. példában leírt 2.105 10,4.10s 5,2 2. „ „ 2.105 9,6.10s 4,8 3. „ „ 2.105 6,2.10s 3,1 4 0.15.105 1,5.10s 10 0.15.105 1,5.10s 10 6. „ „ 2.10s 8,6.10s 4,3 7. „ „ 2.105 7,9.10s 4,0 8. „ » 2.105 9,4.10s 4,7 9. „ „ 2.105 8,1.10s 4,0 10. „ „ 2.105 8,2.10s 4,1 11. példa A 2. példában leírt mikrohordozót alkalmazzuk primer csirkeembriósejtek tenyésztésére. A mikrohordozót konzisztens maradékának 5000 cm2 tenyészfelületet biztosító 18 ml-ét 50 ml Henk-féle sóoldatban szuszpendáljuk. A Henk-féle sóoldatot 55 10 perc múlva leöntjük és a mikrohordozót 5% boíjúszérumot 0,25% laktalbumin hidrolizátumot 0,1% galaktózt, 20 mmól HEPES-puffer oldatot és antibiotikumot tartalmazó 50 ml-nyi 199 sz. tápoldatban szuszpendáljuk. A199 sz. tápoldatot összetételét R.Adams „Methoden der Zellkultur für Biochemiker” ismerteti. Az összetétel a következő: 199 sz. tápközeg Morgan és munkatársai, 1950,1955 előirata 50 Aminosavak mg/1 L-alanin 50,0 L-arginin-HCl 70,0 DL-aszparaginsav 60,0 L-cisztein-HCl 0,1 L-cisztein 20,0 mg/1 DL-izoleucin 40,0 DL-leucin 120,0 L-lizin-HCl 70,0 DL-metionin 30,0 DL-fenil-alanin 50,0 5
