201775. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon tisztítására
HU 201775 B gálással gyűjtjük össze. A sejteket 1 mmól cink-kloridot tartalmazó 20 mmólos trisz.HCl pufferben (pH= 7,5) reszuszpendáljuk. A sejteket magasnyomású homogenizátorban roncsoljuk el. A sejt homogenizátumot lecentrifugáljuk és a felülúszót összegyűjtjük. A felülúszóhoz annyi sósawal pH = 8-ra beállított 10%-os (térf/térf.) polietilén-imint (PEI) adunk, hogy a végsó PEI koncentráció maximum 0,8% legyen. Az anyagot lecentrifugáljuk és a felülúszót összegyűjtjük. II. Kromatografálás kvatemer aino-etil (QAE) oszlopon A PEI felülúszó pH-ját 8,7-re állítjuk be 4 n nátrium-hidroxiddal. Az oldathoz ionmentes vizet adunk, hogy vezetőképességét 10 mS alá vigyük. Az anyagot QAE oszlopra visszük fel úgy, hogy 1 liter gél terhelése 50 g proteinnél több ne legyen. Az oszlopot előzőleg20 mmólos nátrium-4-(2-hidroxietil)- 1-piperazin-propán-szulfonát pufferrel, amely 0,1% 2-ME-t tartalmaz és pH-ja 8,7, egyensúlyozzuk ki. Az összegyűjtött protein oldatot a III. lépcsőben kromatografáljuk. III. Kromatografálás karboci-metil (CM) oszlopon A 2. lépésből származó protein eluátum pH-ját 7,5-re állítjuk be 4 n sósavval és 2-ME-t adunk hozzá 0,1% végkoncentrációig. Az oldat vezetőképességét 20 mS-re állítjuk be vagy ez alá visszük úgy, hogy 0,1% 2-ME tartalmú ultraszűrt vízzel hígítjuk. Az oldatot 0,2 p,-os megszűrjük, majd CM oszlopra visszük fel úgy, hogy 1 liter gélre legfeljebb 35 g proteint terhelünk rá. Az oszlopot előzőleg 20 mmól trisz.HCl-t és 0,1% 2-ME-t tartalmazó pufferrel (pH = 7,5) egyensúlyoztuk ki, amelynek vezetőképességét nátrium-klorid hozzáadásával 20 mS-re, vagy ennél alacsonyabb értékre állítottuk be. Az oszlopot legalább 2 oszlop-térfogatnyi kiegyensúlyozó pufferrel mossuk. A gamma interferont nátrium-klorid grádienssel eluáljuk 0-0,5 mól tartományban. A nátrium-klorid a kiegyensúlyozó pufferben van oldva. A frakciókat egyesítjük és SDS-PAGE-el vizsgáljuk. IV. Kromatografálás fenti oszlopon Fenil oszlopon akkor kromatografálunk, ha az SDS-PAGE magasabb molekulatömegű szennyezések jelenlétét mutatja ki. Az oldat vezetőképességét 50-75 raS-re állítjuk be nátrium-klorid hozzáadásával, mielőtt felvisszük a fenil oszlopra. A terhelés nem lehet nagyobb, mint 15 g protein/1 liter gél. Az oszlopot előzőleg 20 mmól trisz.HCl, 0,5 mól nátrium-klorid és 0,1% 2-ME tartalmú pufferrel (pH= 7,5) egyensúlyozzuk ki. Miután az anyagot rávittük az oszlopra, legalább egy töltettérfogatnak megfelelő mennyiségű kiegyensúlyozó puffert folyatunk át rajta. Az oszlopot 20 mmól trisz.HCl, 0,15 mól nátrium-klorid és 0,1% 2-ME tartalmú pufferrel (pH» 7,5) eluáljuk. Az aktív frakciókat az SDS-PAGE és a vírus ellenes aktivitás meghatározása alapján egyesítjük. V Kicsapás ammónium-szulfáttal Abban az esetben, ha karboximetil (III. lépés) 19 vagy fenil (IV. lépcső) oszlop kromatografálás után az egyesített frakciók protein koncentrációja 0,2 mg/ml-nél alacsonyabb, az oldatot ultraszűréssel koncentráljuk, ahol a membrán kizárási molekulatömege 10.000 . Az oldathoz ammónium-szulfátot adunk 40-60% telítésig. A csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze és ha szükséges, -20 °C-on tároljuk. VI. Kromatografálás Sephadex G-100 oszlopon Az ammónium-szulfátos csapadékot 20 mmól trisz.HCl, 0,5 mól NaCl és 0,1% 2-ME tartalmú pufferben (pH = 7,5) oldjuk fel. Az oldatot lecentrifugáljuk, majd 0,2 p.-os szűrőn szűrjük. A szűrt oldatot Sephadex G-100 oszlopra visszük fel. Az oszlopot előzőleg ugyanezen pufferrel egyensúlyozztuk ki. A terhelés nem lehet több, mint 3,5 g protein/1 liter gél. Az oszlopot ugyanezen pufferrel eluáljuk és a frakciókat az elvégzett SDS-PAGE eredménye alapján egyesítjük. VII. A tisztított gamma interferon dializálása Az egyesített Sephadex G-100 frakciókat 15 mmól nátrium-foszfát, 8 mmól nátrium-citrát és 6 mmól L-cisztein.HCl tartalmú oldattal (pH = 5,0) szemben dializáljuk. A dialízist úgy végezzük, hogy a pufferen keresztül állandóan nitrogént áramoltatunk át és 5 órán belül minimum kétszer cseréljük a puffert. Ha szükséges, a dializált oldatot ultraszűréssel (a membrán kizárási molekulatömege 10.000) koncentráljuk úgy, hogy protein koncentrációja 1 mg/ml-nél nagyobb legyen. A tisztított gamma interferon oldatát 0,2 p,-os szűrőn szűrjük és -20 °C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten tároljuk. A tisztított gamma interferont több hónapon át lehet tárolni -20 °C és -30 °C között, ha a gamma interferon tartalmú oldathoz 50% glicerint adunk. A gamma interferont úgy készítjük el felhasználásra, hogy 0,2 jx-os szűrőn megszűrjük és az oldatot 20 mmól nátrium-foszfát és 6 mmól L-cisztein tartalmú oldattal (pH = 6,8) szemben dializáljuk. Egy másik dializáló oldat 15 mmól nátrium-foszfátot, 8 mmól nátrium-citrátot és 6 mmól L-cisztein.HClt (pH körülbelül 5) tartalmaz. Egy 8 órás dializálási időtartam után — mialatt állandóan nitrogént áramoltatunk át a rendszeren—előnyös, ha az oldatot membrán (kizárási molekulatömege 10.000) szűrjük. A kapott termék legalább 95%-os tisztaságú gamma interferon és a kitermelés meghaladja a körülbelül 5%-ot. 20 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás rekombináns DNS-technikával előállított és interferon termelésére képes mikroorganizmusok által termelt interferon hatású polipeptid kivonására és tisztítására a polipeptidet termelő mikroorganizmusok tenyészetéből nyert sejtek feltárása és a sejthomogenizátum cink- vagy rézsójával, majd poli(etilén-imin)-nel végzett kezelésével történő előtisztítása után kapott oldatból, azzal jellemezve, hogy az interferont tartalmazó oldatból 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
