201770. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 4,5,7,8-tetrahidro-6H-tiazolo[5,4-d]azepinek és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 201770 B 15 I. Táblázat folytatása 16 Vegyület (példa száma) D2-Ki [mmól] o2-IC50a2-IC5o/ [mmól] /D2-Ki 15 0,95 590 621 16 1,4 400 285 24a 1,7 900 529 ”A”-vegyület 5 24 4,8 ”B”-vegyület 13 410 31,5 ”C”-vegyület 410* 5100 12,4 *A „C”-vegyület = 2-amino-6-(2-fenil-etil)-4,5,7,8-tetrahidro-6H-tiazolo[5,4-d]azepin (lásd a 1.321.509. számú nagy-britanniai közzétételi iratot). 3. Szerotonin-IA (5-HTlA)-receptorokhozvaló affinitás meghatározása [3H]--8-OH-DPAT-vel végzett elnyomási kísérletekkel. [S. J. Peroutka /J. Neurochem. 42, 529 (1986)/ módszerének H. Gozlan és társai /J. Receptor Research 2,195 (1987)/ szerinti módosítása]. Membránpreparálás: Egy hím patkányt Chbb: Thom törzs; kb. 200 g) leölünk. Az agyát kivesszük, és jéghideg pufferba (50 mmól/1 trisz-HCl + sósav pH = 7,4-ig szobahőmérsékleten) rakjuk. A frontális kérget kipreparáljuk; megállapítjuk a nedves súlyát. Homogenizáljuk 40-szeres térfogatú pufferban (Polytron, 6-os állás, 10 másodperc), majd hűtőcentrifugában 45000 gnél 20 percig centrifugáljuk. Az üledéket 100-szoros térfogatú pufferban mossuk, és az előbbiekhez hasonlóan újból centrifugáljuk. A kapott üledéket 40-szeres térfogatú pufferban reszuszpendáljuk, és 37 °C-on 10 percig előinkubáljuk. Hozzáadunk még 60-szoros térfogatú puffert, és az előbbiekhez hasonlóan centrifugáljuk. A kapott üledéket 100-szoros térfogatú pufferral mossuk, és az előbbiekhez hasonlóan újból centrifugáljuk. Az üledéket pufferban (0,8 ml/10 mg) reszuszpendáljuk, és röviden politronozzuk. Ezt a kész szövethomogenizátumot az inkubációig jégben hűtjük. Kötődésvizsgálat: 0,8 ml szövethomogenizátumot (= 10 mg nedves súly) 0,1 ml [3H]-8-OH-DPAT oldattal (körülbelül 0,1 mmól/1 végkoncentráció), valamint a vizsgálati anyag (növekvő koncentrációjú) oldatának 0,1 miével szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk (3 párhuzamos). Az inkubálást Whatman GF/B szűrőn át végzett gyors szűréssel leállítjuk; a szűrőt (gyártója az Ismatec cég) kétszer öblítjük 5-5 ml jéghideg pufferral. A szűrő radioaktivitását folyadékszcintillációs méréssel határozzuk meg. A nem-specifikus kötődést 10* mmól szerotonin jelenlétében mérjük. Adatelemzés: A specifikus kötődés az összkötődésből a nemspecifikus kötődés levonásával adódik. A 3 párhuzamos meghatározás középértékeit merőleges koordinátarendszerben ábrázoljuk. [Abszcissza (logaritmikus): vizsgálati anyag koncentrációja (mól/1); ordináta (lineáris): a minták radioaktivitása (d dpm)]. <1 Az ICso-érték az a koncentráció, amely a [ H]- 20 8-OH-DPAT [[3H]-8-hidroxi-2-(dipropil-amino)tetralin] kötődését 50%-kal gátolja. 4. Szerotonin-2- (5-HT2)-receptorokhoz való affinitás meghatározása [3H]-spiperonnal végzett 25 elnyomási kísérletekkel. [S. J. Peroutka és társai /Mol. Pharmacol. Ifi 700 (1979)/ módosított módszere]. Membránpreparálás: Egy hím patkányt (Chbb: Thom törzs; kb. 200 g) 30 leölünk. Az agyát eltávolítjuk. A frontális kérget kipreparáljuk, és jéghideg 0,32 mólos szacharóz-oldatba rakjuk; megmérjük a nedves súlyát. Utána 10-szeres térfogatú 0,32 mólos szacharóz-oldatban 1 percig homogenizáljuk 800 ford./perc-nél egy 35 Potter S(Braun cég, Melsungen) homogenizátorban. A homogenizátumot 10 percig centrifugáljuk 1000 g-nél (=3000 ford./perc a 8x38 ml-es rotornál) egy hűtőcentrifugában. A felülúszót dekantáljuk, és homogenizáljuk (Polytron, 5 helyzet, 40 1 perc); az üledéket eldobjuk. 5 ml ( = 0,5 g nedves súly) így kapott szövetszuszpenziót pufferral (50 mmól trisz.HCl; pH= 7,7 szobahőmérsékleten) 40 ml-re feltöltünk. Kötődésvizsgálat: 45 A pufferolt szövethomogenizátum 0,8 ml-ét (= 10 mg nedves súly) 0,1 ml [3H]-spiperon-oldattal (körülbelül 0,2 mmól/1 végkoncentráció), valamint a vizsgálati anyag (növekvő koncentrációjú) oldatának 0,1 ml-ével 37 °C-on 15 percig inkubáljuk. (3 50 párhuzamos mérés). Az inkubációt Whatman GF/B-szűrőn át végzett gyors szűréssel leállítjuk; utána a szűrőt (gyártja az Ismatec cég) háromszor 5-5 ml jéghideg pufferral maximum 10 másodpercig öblítjük. A szűrő radioaktivitását folyadékszcin- 55 tillációs méréssel határozzuk meg. A nem-specifikus kötődést 10'* mól/1 ketanserin jelenlétében mérjük. Adatelemzés: A specifikus kötődés az összkötésből a nem-spe- 60 cifikus kötődést levonva adódik. A 3 párhuzamos meghatározás középértékeit egy derélüzögű koordinátarendszerbe visszük fel, mint a 3. pontban. Az ICso-érték az a koncentráció, amely a [3H]-spiperon specifikus kötődését 50%-kal gátolja. 65 A következő II. táblázatban a találmány szerinti 9
