201760. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 14-spiro-heterociklusos-14,15-dihidro-eburnamenin-származékok és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 Ilü 201760 A Az antioxidáns hatás vizsgálata patkányagybői preparált mikroszómákon történt, melyei T.J.Player; A.A. Horlon: J.Neurochem. .77, (2) 122—126 (1081). módszere alapján vizsgáltunk, valamint patkányagy homogonál.mnon, melyei. J.M.Mraughler; J.F.Progenzer; R.b.Chase; L. A. Dunnán; E.J.Jacobsen and J.M.MrCall: J.Biol.Ohem.: 262, (22)10438-10440 (1987) módszere alapján végeztünk el. NADPH indukált lipid peroxidáció agy mikro•s zúnmban: A mikroszóma preparálásához 150-250 g-os him Hannover-Wistar patkányokat használtunk. A patkányok dekapitálása után a teljes agyat eltávolítottak és tízszeres térfogatú jéghideg 0,25 mólos szacharóz oldatban homogenizáltuk. A homogenátumot 15.000 g-vel 10 percig +4 °C-on centrifugáltuk HI-SPIN centrifugán, majd a felülúszót összegyűjtöttük és 78.000 g-vel 60 percig +4 °C-on centrifugáltuk MSE Superspeed centrifugán. A csapadékot 0,15 M-os KCl oldatban szuszpendáltuk. Az ily módon előállított mikroszómát szárazjég-acetonban lefagyasztottuk, majd felhasználásig -70 °C-on tároltuk. Az inkubációs elegy összetétele a következő volt; 50 niM TKIS-HC1 pH: 6,8; 0,2 inM FeCta; 1 mW K.H2PO4; 0,5 mM ADP; 0,2 mg mikroszóma, valamint a vizsgálandó vegyület.ek. Az inkubációs végtérfogat 1 ml, az inkubációs idő 20 perc, az inkubálés hőmérséklete 37 °C volt. A iipid peroxidációt 0,4 mM NADPH adásával indukáltuk. (A vak minták nem tartalmaztak NADPH-t.) A reakció leállítását 0,375 ml leállító oldattal végeztük, melynek összetétele a következő: 40% TCA: 5 M HCl = 2:1. A nialondialdehid képződést tiobarbitursav segítségével határoztuk meg. A reakció leéllitása után a mintákhoz 1 ml 1%-os tiobarbitursavat mértünk és 10 percre kb. 100 °C-os vízfürdőbe tettük. Ezután a mintákat 2000 g-vel 10 percig +4 °C-on centrifugáltuk. A színes felülúszó extinkció értékeit 535 nm-n HITACHI 150-20 spektrofotométeren mértük meg. A vegyuleteket koncentráció-hatás őszszefüggésének vizsgálata alapján meghatároztuk a vegyuletek 1C-50 értékeit, melyet az 1. táblázatban tüntettük fel. Fe2 indukált lipidperoxidáció agy homogenizátuniban: Kb. 200-300 g-os Wistar patkányokat dekapitáltunk, majd a teljes agyat elhomogenizáltuk kilencszeres térfogatú Krebs-Ringer pufferben, melynek összetétele a következő: 15 mM HEPES pH: 7,4; 140 mM NaCl; 3,6 mM KCl; 1,5 nM CaCte; 0,7 mM MgClz; 1,4 nM KII2PU1 10 111M glukóz. Ezután meghatároztuk az oldat- fehérjetartalmát, amelyet 10 mg/ml-re állítottunk be. I A gátlószereket 5 ml térfogatban adtuk a 200 ml homogenátumhoz, jeges hűtés mellett majd az így kapott inkubációs eb-gyet 37 °C-on, 20 percig inkubáll.uk. A Fe2' indukált lipidperoxidációt 5 ml 8 mM FelNHih oldat adásával hoztuk létre. Az inkubációs idő letelte után a reakciót 1 ml leállító oldat (melynek összetétele a következő: 0,8 M HCl; 12,5% TCA) adásával állítottuk le, majd a mintákat 2000 g-vel, 10 percig, 4 °C-on Janetzky K-70 centrifugán centrifugáltuk. A felúlúszó 0,5 ml-es részletéhez 1 ml 1%-os TBA oldatot adtunk és a mintákat 20 percre, 100 °C-os vízfürdőbe helyeztük. A kialakult színintenzitást 535 nm-n határoztuk meg HITACHI 150-20 spektrofotométeren. Standardként malondialdehid-bisz-dietilacetált használtunk. /. táblázat Vegyület jele példa száma NADPH ind. LP IC-50 (üM) Fe2* ind.LP 1C-50 (íj Ml 10 04050 19. 47.5-10 06608 20. 6.3 17.8 10 06609 14. 6.3 17.2 A táblázat adataiból látható, hogy a különböző példák szerint előállított vegyuletek mindegyike rendelkezik antioxidáns (lipidperoxidációt gátló) aktivitással. Számos olyan patológiás folyamat ismeretes, amelyekben rendkívül reakcióképes oxigén szabadgyökök(02") felszaporodnak. A szabadgyök-képződés a telítetlen zsírsavak (a membránok fontos alkotórészei) oxidációjához (lipidperoxidációhoz) vezet. Ez egy alacsony specif itású, sejtpusztitó folyamat, amely megváltoztatja vagy megrongálja a biomolekulákat. A sejtek, szervek vagy az egész szervezet különböző szintű funkciói károsodhatnak. A szabadgyök reakciók valószínűleg oki szerepet játszanak az iszkémia által okozott olyan károsodások patogenezisében, mint: iszkémiás bélbetegségek, miokardiélis iszkémía, hemorrágiás sokk, iszkémiával járó cerebrovaszkuláris funkciózavarok, renális iszkémia. Az antioxidáns vegyületek lipidperoxidációt gátló hatásuk következtében védelmet nyújtanak a szabadgyökök okozta károsodások ellen iszkémiás, hipoxiás körülmények között, ezért az antioxidánsok, mint antiiszkémiás, antihipoxiás vegyületek felhasználhatók ilyen kórképek kezelésére. A találmányt az alábbiakban ismertetjük részletesen. A kiindulási (il) általános képletü 14,15- -dihidro-eburnamenin-származék és a (111) általános képletü szerves izocianát-származck 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
