201742. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heterociklusos diszulfidek és az azokat tartalmazó gyógyszer- készítmények előállítására
1 HU 201742 B 2 Az alábbiakban példákat adunk a vegyületek immunserkentő aktivitásaira, valamint az egér immunválasztására gyakorolt hatásukra különböző szabványosított in vitro módszerek szerint végzett kísérletek alapján. Az alkalmazott módszerek - mint ismeretes - különösen alkalmasak immunserkentők, illetve hatásuk minőségének kivizsgálására. /. kísérlet Juheritrocitákkal szembeni késleltetett típusú sejtimmunológiai reakcióra kifejtett hatás (delayed type hypersensitivity, DTH) 5-5 nőnemű, 18-20 g testsúlyú NMRI-egerekből álló csoportot egyedeinek intravénásán 106, illetve 109 db juheritrocitát applikáltunk. Az immunológiában a juheritrocitákat szabvány vizsgálati anyagnak (antigénnek) tekintik sejtbeli és humorális immunreakciók kiváltása szempontjából. Ez a teszt főleg az imunrendszer T-sejtektől függő komponenesének (T helper cells) működőképességéről ad felvilágosítást. A 8. kiviteli példa szerint előállított anyagot, azaz a bisz-(5-karboximetil-4-metil-tiazol-2-il)-diszulfidot a -3., -2., -1. és 0. napon fiziológiás konyhasóoldata alakjában 20, 30, illetve 40 mg/kg dózisban intraperitoneálisan alkalmaztuk. Öt nap múlva mindegyik állatnak 2xl08 db juheritrocitát befecskendeztünk a talpba, és 24 óra elteltével megmértük a láb duzzadását. A láb duzzadását egy késleltetett típusú bőrreakció váltja ki delayed type hypersensitivity, DTH), és szakember tudja, hogy ez a duzzadás a sejtbeli immunválasz mértékének tekinthető (Collins, F. M. és Mackaness, G. B., J. Immunoi. 101, 830-845, 1986). Az 1. táblázatban összefoglalt eredmények azt mutatják, hogy 106 juheritrocitával 106 db juheroxitával végzett immunizálás után a találmány szerint előállított vegyület a sejtbeli immunválaszt fokozza. A fenti kísérletben a serkentés optimuma 30 mg/kg dózis esetén figyelhető meg. 1. táblázat Egerek juheritrocitákkal végzett immunizálása - a sejtbeli immunválaszra (DTH-reakcióra) kifejtett hatás 2 Napi két kezelés a -3., -2., -1. és 0. napon Dózis i.p. %-os duzzadás 106 eritrociták esetében PSB* 24,3±1,3 vizsgált anyag 20 mg/kg 28,3±6,7 vizsgált anyag 40 mg/kg 36,5±6,5 vizsgált anyag 60 mg/kg 31,4±8,7 *PSB-foszfáttal pufferolt konyhasó-oldat (NaCl: 8000 mg/1, KC1: 200 mg/1, Na2HP04.2H20: 200 mg/1). 2. kísérlet A nem-specifikus immunitás serkentésére gyakorolt hatás - az egy magú (mononukleáris) fagociták aktiválása A 8. példa szerint előállított vegyületnek a peritoneál- makrofágok serkentésére kifejtett hatását vizsgáltuk meg 6-8 hetes NMRI-egereken. Nőnemű egereknek panenterálisan, illetve orálisan 25 , 50, 100 illetve 200 mg/kg dózisban adtuk be a vizsgálandó anyagot, míg a kontroll csoportot pufferolt konyhasóoldattal kezeltük. A kezelés után 3 nappal az állatokat leöltük, és peritoneál-marofágjaikat megvizsgáltuk aktiválás szempontjából. A makrogfágok aktiválásának mértékeként egyrészt a lizoszomális enzimek (ß-galaktozidáz, ß-glukuronidäz, N-acetil-D-glükoizaminidáz) kiválasztását határoztuk meg, másrészt hasonló makrofág-kultúrákban a kolloid arány (198 Au) felvétele által kiváltott pinocitózist vizsgáltuk meg. A makrofágok oxidativ anyagcseréjének intezitása aktiválási állapotuk további mérőszámaként tekinthető. Ezen aktivitás meghatározása biolumátok segítségével a kemoluminiszcencia megmérése alapján történik. E célból egyrészt 30 mm átmérőjű Petricsészékben 3xl06 db makrofágot 1 ml TC-199 közeggel, másrészt félgömbaljú polietilén csövecskékben (a kemoluminisztencia meghatározása céljából) 106 makrofágot 100 pl közeggel 5% C02 mellett 37 °C- on inkubáltunk. Egy órás inkubálás után a kultúrákat mostuk az úszó sejtek eltávolítása céljából. A kemoluminiszcenciát (csöves kultúrában) közvetlenül határoztuk meg, míg a Petri-csészéket 37 °C további 24 órán át inkubáltuk, és ezután mértük meg az enzim- és pinocitózis-aktivitást. Az alábbi eredményeket kaptuk: 2. táblázat Az egér peritoneál-makrofágjainak oxidativ anyagcseréjére kifejtett hatás (kemoliminiszcencia: RL-egységek/15 perc) Egyszeri dózis i.p. p.o. PBS "25 mg/kg vizs-^ 50 mg/kg gált 100 mg/kg anyag (^200 mg/kg 2,97±0,28xl0s 7,87±0,28xl05 9,72±0,82xl05 12,8512,37x10s 24,40±3,39xl05 3,65±0,81x10s 6,41±0,42x10s 8,9910,39x10s 11,8510,92x10s 15,6011,98x10s RL-egység - relatív fény-egység Az NMRI-egereken a 8. példa szerinti vegyülettel végzett kezelés mind parenterális, mind orális beadás esetén serkenti a makrofágok aktivitását, azaz stimulálja az immunitást. Az oxidativ anyagcsere fokozása oxigéngyökök keletkezésében és így az ezzel járó mérhető fényben nyilvánul meg. A 25 mg/kg-ot meghaladó dózisok esetében a makrofág-aktivitás dózistól függő emelkedés figyelhető meg parenterális és orális alkalmazáskor egyaránt. A 3. táblázat azt mutatja, hogy a kontroll egerek makrofágjai lizoszomális enzimek (ß-glukuronidäzt, ß-galaktozidäzt, N-acetil-ß-D-glükozamidinäzt) csak csekély mennyiségben választanak ki a kultúra.felülúszó részébe. Az orálisan vagy parenterálisan 72 órán át a hatóanyaggal kezelt egerek egymagú fagocitái a fent említett savas hidrolázenzimeket (ß-Glu, ß-Gal, N-Ac-Glu) észrevehetően nagyobb mennyiségben választják ki egy olyan dózis-hatás-görbe szerint, amely midegyik mért enzim esetében felülmúlja a kontrollt. Megállapítható, hogy a vizsgált anyag serkenti a makrofágok aktivitását és az enzimek szabaddá tételét elősegíti. Az egymagú fagociták pinocitózis-aktivitásának mennyiségi meghatározását Davies és munkatársai módszere szerint végeztük (Davies, P., Allison, A. C. és Haswell, A. D.: Biochem. Biophys. Res. Com. 52, 627, 1973). Ehhez 2 nm részecskeméretű, 4-12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
