201731. lajstromszámú szabadalom • Eljárás helyettesített benzamidok és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 201731 B módszerekkel végzett tesztek (apomorfinnal kiváltott hányás kutyákon) igazolnak. így tehát az (I) általános képletű vegyületek jó antiemetikus aktivitást mutatnak (különösen a kemoterápiás szerekkel kiváltott hányás ellen), nagymértékben specifikus hatással, de mentesek az említett mellékhatásoktól, amelyek az ismert helyettesített benzamid-származék antiemetikus szerek dopaminerg-antagonista tulajdonságából származnak. Számos ma kereskedelmi forgalomban levő antiemetikus hatású helyettesített benzamid (mint a metoklopramid) gasztrokinetikus hatással is rendelkezik, ami alkalmassá teszi ezeket a szereket olyan kóros állapotok kezelésére, amelyek a gyomor-bélrendszer csökkent mozgékonyságával kapcsolatosak: ilyen kóros állapotok például a gyomor elhúzódó ürülése, diszpepszia, puffadás, és a nyelőcsővisszafolyás. Kimutattuk, hogy egyes (I) általános képletű vegyületek a téringerléssel végzett tengerimalac ileum próbában (2. táblázat) - amely egyike a gasztrokinetikus hatás standard vizsgálati módszereinek - a metaklopramidhoz hasonló hatást fejt ki. Mivel az (I) általános képletű vegyületek nem dopaminerg-antagonisták, ezért a kereskedelmi forgalomban lévő szubsztituált benzamidok - például a metoklopramid vagy a kleboprid - fentebb említett mellékhatásait nem idézik elő. Biológiai vizsgálati módszerek A) A 3H-spiperon leszorítása E vizsgálattal kimutatható a vegyületek azon tulajdonsága, hogy patkányagy corpus striatum-ának homogenátumában, in vitro kísérletben a radioaktív spiperon ligandum leszorítására képesek. E vizsgálati módszer alkalmas olyan vegyületek kiválasztására, amelyek a dopaminerg D-2 receptorok iránti affinitással rendelkeznek. 150±10 g testtömegű Charles River törzsű patkányokat lefejeztünk, agyvelejük corpus striatum részét kimetszettük, és száraz jégen fagyasztottuk. A szövetrészeket összegyűjtöttük, és a felhasználásig -80 °C hőmérsékleten tároltuk. A Brinkmann Polytron eszközzel készített corpus striatum homogenátumokat hideg HEPES.KOH pufferoldatban (végső pH-érték 7,4) 39000 x g sebességgel centrifugáltuk. A felülúszót elvetettük, és a pelleteket HEPES.KOH pufferoldatban ismételten szuszpendáltuk, majd a fentiek szerint ismét centrifugáltuk. A felülúszót elvetettük, és a pelleteket 20 °C hőmérsékleten 50 mmól/1 koncentrációjú olyan HEPES.KOH pufferoldatban szuszpendáltuk, amely 0,1 tömeg/térf.% aszkorbinsavat, 10 pmól/1 pargilint, 120 mmól/1 nátrium-kloridot, 5 mmól/1 kálium-kloridot, 2 mmól/1 kalcium-kloridot és 1 mmól/1 magnézium-kloridot tartalmazott (végső pH-érték 7,4), míg a nedves szövetpellet 10 ml pufferelegyben 1 g koncentrációban volt jelen. Az (I) általános képletű vegyületek és az összehasonlító vegyületek 50%-os gátló koncentrációját (IC50-értékét) 3H-spiperonnal szemben a következőképpen határoztuk meg. Olyan kémcsöveket készítettünk elő, amelyek: vagy 100 pl pufferelegyet tartalmaztak (a teljes kötődés esetére: vagy 100 pl pufferelegyet és 100 pl"4 mól/1 D(+)-butaklamolt tartalmaztak (vakkísérlet, azaz a nem specifikus kötés esetére); vagy 100 pl olyan pufferelegyet tartalmaztak, amelyekben 10'7, 10"6 vagy 10"5 mól/1 vizsgálandó vegyület volt jelen. Valamennyi cső tartalmához 100 pl, 3H-spiperont (melyet a New England Nuclear Intézettől szereztünk be) tartalmazó pufferelegyet (2000 beütés az inkubációs elegyben) és 800 pl striatum-szöveti szuszpenziót adtunk. A csövek tartalmát pufferoldattal 1 ml-re hígítottuk, s így a csövek 10"8, 10"7 vagy 10"6 mól/1 koncentrációjú vizsgálandó vegyületet és megközelítőleg 100 pM 3H-spiperont tartalmaztak. A mintákat 37 °C-on 15 percig inkubáltuk, majd üvegrostból álló vákuumszűrőn szűrtük, és folyadékszcintillációs spektrometriával vizsgáltuk. Az ICso-értéket egyetlen vizsgálandó vegyület esetében sem értük el, még a vizsgálandó vegyület legmagasabb koncentrációja (10° mmól/1 = 1000 mmól/1) esetében sem, ezért a 2. táblázatban az eredményeket >1000 mmól/1 esetére adtuk meg. Az összehasonlító vegyületek eseteiben, ha az ICso-értéket az eredeti koncentrációkkal elértük vagy meghaladtuk, a vizsgálatot az eredeti koncentrációk alapján becsült koncentráció negyedrészével, felével, egyszeresével, két- és négyszeresével megismételtük, hogy a lehető legpontosabban megközelíthessük az ICso-értéket. Ez utóbbi eredményeket is a 2. táblázatban foglaltuk össze. Az összes mintákat két ismétlésben vizsgáltuk. B) Az apomorfinnal előidézett hányás gátlása (antagonizálása) kutyán E vizsgálatokhoz vegyes nemű, előzőleg nem éheztetett vadásztacskókat alkalmaztunk. Mind a vizsgálandó vegyületeket, mind az apomorfint vizes oldatban, szubkután úton adagoltuk úgy, hogy a vizsgálandó vegyületet az apomorfin előtt 30 perccel adtuk be. Az apomorfin adagolása után 60 percig figyeltük, hogy a kutyák hánytak-e, vagy a hányástól teljesen védett állapotba kerültek-e (kvantális válasz). Az apomorfint 0,3 mg/kg dózisban adagoltuk. Mivel a vizsgálandó vegyületek apomorfin-gátló hatással lényegében nem rendelkeztek, ezeket 3 mg/kg dózisban adtuk. Az 1. táblázatban >3 mg/kg jelöléssel tüntettük fel, hogy ezzel a dózissal nem értünk el 50%-os gátlást (a hányás megelőzését 50%-ban). Mivel az összehasonlító vegyületek - így a metoklopramid, alizaprid, kleboprid és domperidon - dopaminerg-antagonista hatásúak, ez utóbbi vegyületeket kisebb dózisban adagoltuk; számított ED50- értékeiket az 1. táblázatban foglaltuk össze. Minden egyes vizsgálatot legalább két kutyán végeztünk. C) A ciszplatinnal előidézett hányás gátlása (antagonizálása) vadászmenyéten Érett, kasztrált Fitch-fajtájú, 1,0-1,5 kg testtömegű hím menyéteket 30 mg/kg intraperitoneálisan (i.p.) adagolt pentobarbitál-nátriummal elaltattunk. Az állatok nyakának mellső és hátsó területét leborotváltuk, és 3 cm nagyságú bemetszést végeztünk. A bal nyaki vénát szabaddá tettük, és a koponya felőli végén selyemvarrattal lekötöttük. A vizsgálathoz 18 cm hosszúságú Silastic-anyagból készült, csőalakú tartós katétert alkalmaztunk (belső átmérője 0,05 cm, külső átmérője 0,09 cm) 2 cm hosszúságú polietilén hüvellyel (belső átmérője 0,11 cm, külső átmérője 0,16 cm), amelyet 1000 egység/ml koncentrációjú heparinnal töltöttünk, és külső végét 2,5 cm hosszúságú, mindkét végén hullámosított tűvel zártuk. A nyaki 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
