201682. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina előállítására
9 HU 201 682 B 10 ciájú polipeptideket kódoló plazmid expressziós vektorokat: N -Met- Asp-Pro- [(Asn-Ala-Asn-Pro^s-CAsn-V al-Asp-Pro)1]I1T32-C, ahol n értéke 4 (R64tet32) vagy n értéke 5 (R80tet32), és azokat E. coliban kifejezzük. Azokat a pASl kiónokat, amelyekben n értéke 4 vagy 5, azoktól a kiónoktól, amelyekben n értéke 4-től vagy 5-től eltérő, a fent leírt módon elválasztjuk. Az R64tet32, és az R80tet32 közel azonos mértékben expresszálódott, mint az R48tet32. Az R64tet32-t lényegében az R16tet32i R32tet32 és R48tet32, előállításával kapcsolatban ismertetett módon tisztítjuk. 3C. példa R96tet32 és R112tet32 polipeptid Lényegében a 3B. példában leírtak szerint eljárva állítjuk elő az R96tet32 és R112tet32 polipeptideket (amelyek képletében n értéke 6, illetve 7), az R48-tet32-vel közel azonos mennyiségben. Kiindulási vektorként pR80tet32-t használunk. Noha a tisztított Rtet32 polipeptidekben észlelhető bizonyos mértékű heterogenitás immun-lenyomatos módszerrel, a reakcióképes fő foltok összhangban vannak a protein-festéssel kimutatható sávokkal. Az SDS-PAGE módszerrel meghatározott molekulatömegek a vártnál kb. kétszer nagyobbak, noha az egyes proteinek vándorlása minden egyes előállított polipeptid esetén arányos a tetrapeptid ismétlődő egységek számával. Néhány esetben meghatároztuk az Rtet32 peptidek aminosav-összetételét is, amelyek a várt értékeknek megfeleltek. 4. példa R16G polipeptid A pASl Bam Hl helyére egy 5’-GATCCCGGGTGACTGACTGA -3’ 3’ GGCCCACTGACTGACTCTAG -5’ szekvenciájú szintetikus kötőt illesztve pTerm-et állítunk elő. 10 pg pASl-et 25 egység Bam HI-vel emésztünk. 100 ng Bam HI-vel hasított pASl-et 20 ng szintetikus kötővel kötünk össze, és a pTcrm plazmidot mint a pASl Bam Hl helyén egy beépült kötő-szekvenciát tartalmazó plazmidot azonosítjuk. A fenti vektorban megmarad a Bam Hl hely, és a TGA terminációs kodonoknak a cll protein ATG iniciációs kodonjától lefelé való beillesztését eredményezi, mind a három leolvasási rendszerben. ApR16G plazmidot úgy állítjuk elő, hogy apUC8 1. klónjából származó 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot a pTerm Bam Hl helyre illesztjük, és kiválasztjuk a fent ismertetett módon azokat a kiónokat, amelyek megfelelő orientációban tartalmaznak egyetlen Xho II betoldást A pR 16G-t lényegében a fent ismertetett módon klónozzuk és fejezzük ki E. coli N5151 törzsben. Az R16G szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)!5-(Asn-Val-Asp-Pro)i]„-Gly-C, ahol n értéke 1. A fenti proteinben nincs aromás gyűrűs aminosavmaradék, így a képződött polipeptid mennyiségét nem tudjuk Coomassie Brilliant Blue R-250-es festéssel vizuálisan meghatározni. A CS-proteinre specifikus 5 monoklonális antitesttel végzett immun-lenyomatos analízis (lásd Dame és munkatársai fent idézett munkája) szerint a kívánt polipeptid közel 1 %-át teszi ki az összes sejt-proteinnek, az R16tet32-vel összehasonlítva, amely utóbbinál lehetséges Coomassie Brilliant Blue R-250-es festéssel meghatározni a protein-tartalmat. 4A. példa R32G, R48G, R64G, R80G és R112G polipeptid Az R32G, R48G, R64G, R80G és R112G polipeptideket - amelyek szekvenciája azonos az R16G-vel, de n értéke 2, 3, 4, 5, illetve 7 - a 4. példában ismertetett módon E. coli N5151 törzsben termeljük. A fenti polipeptidek közel azonos mennyiségben képződnek, mint az R16G. Az R48G-t lényegében a 3. példában leírtak szerint tisztítjuk. 5. példa R16LA és R32LA polipeptid A pASl Bam Hl helyére egy 5 ’ -GATCCGCTGCGTT -3’ GCGACGCAACTAG -5’ szekvenciájú szintetikus kötőt illesztve pTerm2-t állítunk elő, lényegében a 4. példában leírt módon. A pTerm2-ben megmarad a Bam Hl hely. A pUC8 1. kiónból származó 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot a fent ismertetett módon illesztjük be a pTerm2 Bam Hl helyére. A pR16LA és pR32LA kiónokat, amelyek egy, illetve két Xho II beillesztést tartalmaznak a megfelelő orientációban, lényegében a fent ismertetett módon választjuk ki. Az R32LA-t lényegében a 3. példában leírt módon tisztítjuk. A pR16LA-t és pR32LA-t a fent ismertetett módon klónozzuk és fejezzük ki E. coli N515I törzsben. Az R16LA és R32LA szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)i5-(Asn-Val-Asp-Pro),]„-Leu-Arg-C, ahol n értéke 1, illetve 2. A C-terminális leucin és arginin a pTerm2-ben lévő szintetikus kötőből származik. Az R16LA közel 1%-át teszi ki az E. coli összes proteinjének, míg az R32LA az összes sejt-proteinnek közel 5%-a. 6. példa R16NS1 polipeptid A pASldeltaEH plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pASl pBR322 eredetű nem létfontosságú Eco Rí - Hind III régióját töröljük. 10 pg pASl-et 20 egység Eco RI-vel és 20 egység Hind III-mal hasítunk, 200 pl puffer-közegben, DNS-polimerázzal (Klenow) kezeljük, ligázzal zárjuk, és E. coliba transzformáljuk, lényegében a fent ismertetett módon. Azonosítunk egy olyan kiónt, amelyből a 29 bázispárból álló Eco Rí - Hind III fragmens törölve van. A pASldeltaEH Bam Hl helyére beillesztjük a pAPR801 1236 bázispárból álló Bam Hl fragmentumát [Young és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 80, 6105 (1983)], amely az influenza vírus (A/PR/8/34) NS1 kódoló régióját tartalmazza, ami 861 virális eredetű bázispárból és a pBR322-ből származó 375 bázispárból áll. A kapott pASldeltaEH/801 plazmid az autentikus NSl-et (230 aminosav) kódolja. A fenti plazmidban megmarad a Bam Hl hely, a cll transzlációt indító hely és az NS1 kódoló szekvencia között. 10 pg pASldeltaEH/801 plazmidot 20 egység Eco RI- vel és 20 egység Sál I-gyel hasítunk, 200 pl nagy ioncrősségű pufferten (50 mmól/1 Tris-HCl, pH 7,5, 1 mmól/1 DTT, 10 mmól/1 MgCl2, 100 mmól/1 NaCl), 37 ’-on 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
