201682. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina előállítására
11 HU 201 682 B 12 órán keresztül, DNS-polimeráz nagy fragmentummal (Klenow) kezeljük és ligázzal zárjuk, lényegében a fent leírtak szerint. Izolálunk egy olyan kiónt, amelyből a 650 bázispárt tartalmazó Eco Rí - Sal I régió törölve van. A fenti pNSldeltaES plazmid az autentikus NSl-et kódolja. A pR 16NS1 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pUC8 1. kiónjából származó 192 bázispárt tartalmazó Xho II fragmentumot a pNSldeltaES plazmid Bam Hl helyére illesztjük, és lényegében a fent ismertetett módon kiválasztjuk azokat a kiónokat, amelyek megfelelő orientációban tartalmaznak egyetlen Xho II betoldást. ApR 16NS 1-et E. coliban klónozzuk és kifejezzük, és az R16NSl-et lényegében a fentiek szerint tisztítjuk, azzal az eltéréssel, hogy a forralást elhagyjuk. Az R16NS1 szekvenciája az alábbi: N-Mct-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)i5-(Asn-Val-Asp- Pro)1]n-N227, ahol n értéke 1 és N227 az NS 1-ből származó 227 aminosavat jelenti. A fenti módon előállított R16NS1 készítményben az R16NS1 a protein-tartalom több, mint 80%-ára becsülhető, a forralás vagy ioncserélős lépés nélkül. Az R16NS1 meglepően magas, közel 25%-át képezi az összes sejt-proteinnek. 6A. példa R32NS1, R48NS1 és R64NS1 polipeptid Az R32NSl-et (amelynek szekvenciája az R16NS1- ével azonos, és n értéke 2) lényegében a 3. példában leírtak szerint fejezzük ki E. coliban és tisztítjuk abból, a forralás elhagyásával. Az R32NS1 az R16NSl-gyel közel azonos mértékben képződik, és tisztasága is közel azonos. Az R48NSl-et (amelynek szekvenciája az R16NS1- ével azonos, és n értéke 3), és az R64NS 1-et (n értéke 4 az R16NS1 képletében) lényegében a fentiek szerint eljárva állítjuk elő E. coliban. Az R48NS1 közel 10%-át, az R64NS1 közel 5%-át teszi ki az E. coli összes protein-tartalmának. 7 * * 7. példa NS1R48 polipeptid A pR48tetg6 plazmidot Bam Hl-vei hasítjuk és NDS- polimerázzal (Klenow) töltjük be a véget, lényegében a fent leírt módon. A plazmidot ezután Ban II-vei hasítjuk, a fent ismertetett módon, ily módon egy 672 bázispárból álló, 3 Xho fragmentumot hordozó fragmentum és 96 bázispár válik szabaddá a tetraciklin rezisztencia génből. 10 |ig pASldeltaEH/801 plazmidot 20 egység Nco I-gyel hasítunk 200 pl nagy ionerősségű pufferben, 37 °C-on 2 órán át, és a véget DNS-polimeráz nagy fragmentummal (Klenow) töltjük be, a fent ismertetett módon. Az NS 1-ben az Nco I hely a 81. aminosavnak megfelelő kodonban van. A plazmidot ezután Ban II-vel hasítjuk a fent ismertetett módon, ezáltal töröljük a megmaradt NS 1 kodonokat és a tetraciklin rezisztencia gén egy részét, és pASldeltaEH/801-1 plazmidot kapunk. A 672 bázispárból álló Bam Hl (betöltött végű) - Ban II fragmentumot a pASldcltaEH/801-1 plazmidba illesztve állítjuk elő a pNSlR48 plazmidot. A fenti plazmidot az előzőekben ismertetett módon fejezzük ki E. coliban. A kapott NS1R48 szekvenciája az alábbi: N-81N-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)i5-(Asn-Val-A.sp-Pro)1]n.T32-C, ahol 81N azNSl N-tcrminális 81 aminosavját jelenti, n értéke 3, és T32 jelentése a fent megadott. Az NS1R48 az összes sejt-protein közel 5%-át képezi. 8. példa R32N polipeptid 10 pg pR32NSl plazmidot 25 egység Hind III-mal hasítunk, 200 pl puffer-közegben, 2 órán át, 37 °C-on, és a véget DNS-polimcrázzal töltjük be, a fent ismertetett módon, pR32NSl-l plazmidot kapunk. A Hind III hely az NS1 kódoló régiójában az 5. aminosav-maradékot kódoló kodonban van. 100 ng pR32NS 1—1-et ezután a fent ismertetett módon ligázzal zárunk. A kapott pR32N plazmid most egy TAA terminációs kodont tartalmaz az NS1 kódoló szekvencia 5. kodonjában. A pR32N plazmidot a fentiekben ismertetett módon használjuk az R32N polipeptid előállítására E. coliban. Az R32N szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)i5-(Asn-Val-Asp-Pro),]n-N5-C, ahol n értéke 2 és N5 az NS 1 génből származó 5 aminosavat jelenti. Közelebbről, az N5 az alábbi szekvenciának felel meg: -Asn-Thr-Val-Ser-Scr-C. Az R32N az E. coli összes proteinjének közel 5%-át teszi ki. 9. példa Antitest-válasz - ELISA Az R16tet32, R32tet32 és R48tet32 rekombináns proteineket a fentiek szerint tisztítjuk, 0,01 mol/1 koncentrációjú foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,0) szemben (PBS) dializáljuk, alikvotokra osztjuk és -80 ”C-on tároljuk. Az előállított proteineket PBS-sel, alumíniumhidroxiddal (alum) vagy komplett Freund-féle adjuvánssal (CFA) összekeverve 0,5 ml-es dózisokat készítünk, amelyek protein-tartalma 50 pg. A CFA-t (GIBCO, Grand Island, New York, USA) és antigént PBS-ben 1 : 1 arányban emulgeáljuk, 30 perces keveréssel, mechanikus keverőberendezésben. Az alumot gyógyszerkönyvi tisztaságú alumínium-hidroxid-gélből készítjük, PBS-sel végzett hígítással. Az antigént 4 °C-on, 12 órán át rotációs keverőben keverve adszorbeáljuk az alumon. A szuszpenziót további 12 órán át ülepedni hagyjuk, majd a felülúszó megfelelő mennyiségét leöntjük, hogy 0,80 mg Al-t és 50 pg rekombináns proteint kapjunk dózisonként. 6-8 hetes C57B1/6 egereket (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA) (csoportonként 5 állatot) szubkután vagy intraperitoncális úton összesen 50 pg proteinnel immunizálunk. Az állatoknak az első immunizálás után 4 héttel ugyanezen módon újabb dózist adunk, azzal az eltéréssel, hogy azoknak az állatoknak, amelyek az immunogént CFA-ban kapták, az proteint nem-komplett Freund-féle adjuvánsban (IFA) emulgeálva adjuk. Egy hét elteltével a farok véreztetésével kapott teljes vért összegyűjtjük, 4 °C-on megakasztjuk és centrifugálással elkülönítjük és a felhasználásig -80 °C-on tároljuk a szérumokat. Az egyes szérumok reakcióképességét egy 16 aminosavból álló szintetikus pepiiddel szemben - amely a P. falciparum CS-protein négy ismétlődő egységének [(Asn-Ala-Asn-Pro)J felel meg - enzimhez kötött im5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
