201682. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina előállítására
7 HU 201 682 B 8 Bam HI-Hind II fragmentumának poii(akril-amid) gél-clcktroforézisé vei, amelynek Hind II helye a tetR géntől lefelé helyezkedik el, és a Bam Hl hely a eil ATG és a beillesztett fragmentum csadakozásánál van a helyesen orientált plazmidban. A fenti pRlőtet^ plazmid szerkezete az alábbi: pBR322 PL ismétlődő egység tetR S pBR322 BH BB ahol BH jelentése Bam Hl hely, B jelentése Ban II hely és S jelentése tcrminációs kodon. A pR16tetg6-lal transzformáljuk az E. coli N5151 törzset (clts857) és a CS-protein tetrapeptid ismétlődő egységének termelődése szempontjából vizsgáljuk, western biot analízissel. A képződött protein szerkezete az alábbi: N-Met-Asp-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)u-(Asn-Val-Asp-Pro)rT86-C ahol T86 a pASl-ben lévő tetraciklin rezisztencia génből származó 86 aminosavat jelenti. Az N-terminális metionin (Met) aminosav-maradék szintén a vektorból származott, közelebbről a cll protein iniciációs kodonból. 2A. példa R32tetM és R48tet86 polipeptidek 10 pg tisztított pR16tetg6 plazmid DNS-t 25 egység Bam Hl restrikciós endonukleázzal emésztünk 200 pl puffer-közegben, 37 *C-on, 2 órán át A fenti DNS 100 ng-ját ezután 1 pg fent ismertetett 192 bázispárból álló Xho II fragmentummal kapcsoljuk össze. Előállítjuk az alábbi szekvenciájú polipeptideket kódoló expressziós vektorokat: N-Met-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)i5-(Asn-Val-Asp-Pro)1]D.T86-C, ahol n értéke 2 (R32tet«6), vagy n értéke 3 (R48tct«6), és azokat E. coliban fejezzük ki. Azokat a pASl kiónokat, amelyekben n értéke 2 vagy 3, elválasztjuk azoktól a klónoktól, amelyekben n értéke 2-től vagy 3-tól eltérő, mint azt fent ismertettük. Minden egyes vizsgált klón a helyes orientációban tartalmazza a beépült fragmentumot Mind az R32tettó, mind az R48tetg6 közel azonos mértékben expresszálódott az Rlótet^-tal, amint azt immun-lenyomatos analízissel (immunoblolting) kimutattuk. Az Rtetíí proteinek immun-lenyomatos analízisével kimutatható volt a termékek heterogén összetétele, amelyet Coomassie Brilliant Blue R-250-es festéssel nem lehetett látni. Ezek a proteinek úgy tűnik, hogy közel fele mennyiségben az alább ismertetett Rtet32 polipeptidektől állnak. Úgy tűnt, hogy a kisebb degradációs termékek mérete arányos a kiónban lévő tetrapeptid ismétlődő egységek számával. A fenti proteinek instabilitása a hcterológ COOH-terminális vég degradációjának tulajdonítható valószínűleg. 3. példa Rióiét] 2 polipeptid 10 pg tisztított pR16tctM DNS-t 25 egység Ban II restrikciós endonukleázzal hasítunk, 200 pl puffer-közegben, 37 ‘C-on, 2 órán át. A fenti hasított DNS 100 ng-ját ezután ligázzal zárjuk. A fenti művelet eredményeként töröltünk egy 14 bázispárból álló Ban II fragmentumot, és egy tcrminációs kodon alakult ki éppen a megmaradt Ban II helytől lefelé. Az így kapott pR16tet32 plazmidot használjuk fel E. coli N5151 törzsben az R16tct32 kifejezésére, majd a tenyészetből tisztítjuk az R16tet32-t. Az R16tet32-t tartalmazó E. coli 30 g-ját (nedves tömeg) 200 ml A-puffcrbcn [50 mmól/1 Tris-HC1, pH 8,0,2 mmól/1 etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA), 0,1 mmól/1 ditiotreitol, 5 térfogat% glicerin] újraszuszpendáljuk. 0,2 mg/ml végkoncentrációban lizozimet adunk hozzá, és az elegyet jégen 30 percen át inkubálva lizáljuk a sejteket Az elegyet ezután Waring homogenizátorban 3 percen át magas fordulatszámot alkalmazva kezeljük, majd 1 percen át Brason 350 szonikátorban ultrahangos kezeléssel szétnyírjuk a bakteriális DNS-t. 0,1 vegyes% végkoncentrációban nátrium-dczoxi-kolátot adunk az elegyhez, és 30 percen át 4 ‘C-on keverjük. A szuszpenziót ezután 12 000 g-vel 30 percen át centrifugálva eltávolítjuk a sejt-törmelékeket. A felülúszót egy lombikban összegyűjtjük és forró vízfürdőn 10 percen át inkubáljuk, majd 12 000 g-vel 30 percen át centrifugáljuk. Azt tapasztaltuk, hogy közel az összes E. coli protein kicsapódott a hőkezelési lépés alatt, és kiülepedett a centrifugáláskor, míg az R16tct32 protein oldatban maradt és a felülúszóban gyűlt össze. A felülúszót összegyűjtjük és 20%-os telítettséget biztosító koncentrációban lassan ammónium-szulfátot adunk hozzá. A fenti módon szeleku'ven kicsapott R16tet32-t centrifugálással (12 000 g, 30 perc) összegyűjtjük. Ezen a ponton az R16tet32 protein 95%-nál nagyobb tisztaságú, az egyéb szennyező bakteriális proteinek tekintetében. Az egyéb anyagok - például proteinek, szénhidrátok, nuklcinsavak vagy lipopoliszacharidok - által okozott maradék szennyezést egy végső kromatográfiás tisztítással - például ioncserélős kromatográfiával, fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával, fenil- Sepharose kromatográfiával, méret szerinti elválasztással stb. - távolíthatjuk el. A képződött tisztított RÍ6tet32 közel 5%-át teszi ki az összes E. coli proteinnek, azaz 30-60 mg/1 koncentrációjú, amint az Coomassie Blue festéssel megállapítottuk. Az R16tet32 szekvenciája az alábbi: N-Met-Asp-F*ro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)i]n-T32-C, ahol n értéke 1 és T32 a tetraciklin rezisztencia génből származó 32 aminosavat jelenti. Közelebbről, a T32 szekvenciája az alábbi: -Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His-Arg-Arg-His-Arg-Cys-Gly-Cis-Trp-Arg-Leu-Tyr-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser-Gly-Ser-C, a megmaradt Ban II hely a 30. és 31. aminosav között van. 3A. példa R32tetn és R48tet32 polipeptidek Lényegében a 3. példa szerint eljárva állítjuk elő az R32tet32-t és R48tet32.t (azaz egy olyan R16tet32-nek megfelelő szekvenciát, amelyben n értéke 2, illetve 3) E. coliban, és azonos hozammal és tisztasági fokkal izoláljuk, mint az R16tet32-t Kiindulási vektorként pR32tetg6-ot, illetve pR48tet«6-ot használunk. 3B. példa R64tetn és R80tet32 polipeptid 10 pg tisztított pR48tet32 plazmid DNS-t 25 egység Bam HI-val emésztünk 200 pl puffer-közegben, 37 ‘C- on, 2 órán át. 100 ng fenti DNS-t ezután 1 pg fent ismertetett, 192 bázispárt tartalmazó Xho II fragmentummal kapcsolunk össze. Előállítjuk az alábbi szekven-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
