201682. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina előállítására
5 HU 201 682 B 6 R16tet32, R32tet32, R48tet32i R64tet32, R48G, R32LA és RlötetgÉ tisztítására, amint azt a példákban ismertetjük, míg az R16NS1 és R32NS1 melegítése ezen polipeptidek kicsapódását okozta. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet tovább tisztíthatjuk, például szelektív kicsapószer hozzáadásával, majd egy kromatográfiás lépéssel, például ioncserélő kromatográfiával vagy fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával. A találmány szerinti eljárással előállított vakcinában a találmány szerinti eljárással előállított polipeptid vizes, előnyösen fiziológiás pH-n pufferolt oldatát közvetlenül használhatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidet - liofolizálás után vagy anélkül - különféle ismert adjuvánsokon is adszorbeálhatjuk vagy azokkal keverhetjük. A fenti adjuvánsok többek között alumínium-hidroxid, muramil-dipeptid vagy szaponinok, így Quil A lehetnek. További alkalmazási módként például a polipeptid mikrorészecskékbe - például liposzomákba - való kapszulázást említhetjük. Úgy is eljárhatunk, hogy a polipeptidet egy immunstimuláló makromolekulával - például elölt Bordatellával vagy egy tetanusz toxoiddal - kapcsoljuk össze. A vakcinák előállítását például a New Trends and Developments in Vaccines, szerk. Voller és munkatársai, University Park Press, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, 1978 irodalmi helyen ismertetik általánosan. A liposzomákba való kapszulázást például Fullerton (US-PS 4 235 877) ismertette. A proteinek makromolekulákhoz kapcsolását például Likhite (USPS 4 372 945) és Armor és munkatársai (US-PS 4 474 757) írták le. A Quil A használatát például Dalsgaard és munkatársai [Acta Vet. Scand. 18, 349 (1977)] munkájából ismerjük. A vakcina-dózisokban a polipeptid mennyiségét úgy választjuk meg, hogy azzal az immunprotcktív válasz elérhető legyen, a szokásos vakcinák hátrányos mellékhatásai nélkül. A fenti dózis az alkalmazott specifikus polipeptidtől, valamint attól függ, hogy a vakcina adjuvánst is tartalmaz-e. Általában minden egyes dózis 1- 1000 pg, előnyösen 10-200 pg polipeptidet tartalmazhat. Az egyes vakcinák optimális dózisát szokásos módon, például az antitest-titer meghatározásával vagy a kezelendő alany más válaszának mérésével határozhatjuk meg. Az első vakcinálást követően a kezelt alany előnyösen kb. 4 hét múlva újabb adagot kap, és ezt követően minden 6 hónapban megismételjük az adagolást, egészen a fertőzésveszély fennállásáig. A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni. A CS- proteint kódoló szekvenciát James Webertől (Walter Reed Army Institute for Research) kaptuk, egy standard E. coli klónozó vektorba, a pUC8-ba (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD, Amerikai Egyesült Államok) az Eco Rí helynél illesztett tanPFl (Dame és munkatársai, fent idézve) 2337 bázispárból álló Eco Rí fragmens formájában (lásd la. ábra). A kapott pUC8 származékot a továbbiakban pUC8 1. kiónnak nevezzük. 1. példa CS-protein származék 40 pg tisztított pUC8 1. klón plazmid DNS-t 100 egység Stul és 100 egység Rsal restrikciós endonukleázokkal emésztünk, 400 pl puffer-közegben (amelynek összetétele 50 mmól/1 Tris, pH 7,5,50 mmól/1 NaCl, I mmól/1 ditiotreitol (DTT) és 10 mmól/1 MgCl2), 37 °C-on, 1,5 órán át. A kapott, a CS-protein első 18 aminosavját kódoló, 1216 bázisból álló fragmentumot 5% poli(akril-amid)-gélen elektroforézissel (PAGE) választjuk el. 10 pg pASl expressziós vektort (ATCC 39 262) 200 pl puffer-közegben 1,5 órán át, 37 'C-on 25 egység Bam Hl restrikciós endonukleázzal emésztünk. A szétvágott plazmidot ezután DNS-polimeráz nagy fragmentummal (Klenow, 5 egység; 20 mmól/1 Tris-HCl, pH 7,5,7 mmól/1 MgCl2,60 mmól/1 NaCl, 6 mmól/12-mcrkapto-etanol és 0,25 mmól/1 a négy dezoxinukleotid-trifoszfát mindegyikéből; 25 ”C, 15 perc) kezeljük, a Bam Hl helynél a vég betöltésére. A CS-gén fragmentum 1 pg-ját ezután 100 ng fenti vektorral kötjük össze, 30 pl ligáz-pufferben (50 mmól/1 Tris, pH 7,5, 1 mmól/1 DTT, 10 mmól/1 MgCl2, 100 pmól/1 rÁlP), 1 egység T4-DNS ligáz segítségével, 16 órás reakcióidőt alkalmazva, 4 °C-on. A ligációs elegyet E. coli MM294CP törzsbe (Am. N. X. Acad. Sei 478, 233-248.) transzformáljuk, ampicillin-rezisztens telepeket kapunk, és ezeket vizsgáljuk a CS-gén fragmentum pASl-be való beépülése szempontjából. Egy megfelelő szerkezetűnek talált plazmidot (pCSP) azonosítás után E. coli N5151 törzsbe transzformálunk (clls857) [(Mol. Cell. Bioi. 5, (5), 1015-124 (1985)] és a teljes hosszúságú CS-protein expressziója szempontjából vizsgáljuk. (Aprotein-N-terminálisánál a 18 aminosav törlése az autentikus CS-protein hasított szignálpeptidjének felelne meg.) A sejteket Luria-Bertani tápközegben (LB) tenyésztjük 32 °C-on, amíg a tenyészet abszorpciója 650 nm-en (A650) eléri a 0,6 értéket, majd a hőmérsékletet 2 órán át 42 ”C-on tartjuk, az expreszsziós plazmid PL-promotere transzkripciójának beindítására és a CS-protein származék ezt követő transzlációjára. A sejttenyészetből 1 ml-es mintákat veszünk, tömörítjük, lizáló pufferben [10 mmól/1 Tris-HCl, pH 7,8, 25 térfogat% glicerin, 2% 2-merkapto-etanol, 2% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), 0,1 % brómfenolkék] újraszuszpendáljuk és 105 °C-os melegítő egységben 5 percen át melegítjük. A proteineket SDS-PAGE segítségével elválasztjuk [13% akril-amid, 30:0,8 akrilamid: bisz (akril-amid) arány], A proteineket nitro-ccllulózra visszük és az E. coliban termelődött CS-proteint ún. western biot analízissel mutatjuk ki, a P. falciparum tetrapeptid ismétlődő szakaszával reagáló öt monoklonális antitestet használva (Dame és munkatársai fent idézett munkája). 2. példa R16tet8á polipeptid 100 pig tisztított pUC8 1. klón DNS-t 40 egység Xho II restrikciós endonukleázzal emésztünk, 400 pl pufferközegben, 37 °C-on, 16 órán át. A CS-protein 16 tetrapeptid ismétlődő egységét kódoló, 192 bázispárból álló fragmentumot ezután PAGE segítségével izoláljuk. A pASl expressziós vektort az 1. példában ismertetett módon Bam Hl restrikciós endonukleázzal hasítjuk. 1 pg 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot 100 ng pÁS 1-hez kötünk, annak Bam Hl helyén, az 1. példában leírt módon. A ligációs elegyet E. coli MM294CP törzsbe transzformáljuk. Egy, a pASl Bam Hl helyén megfelelő orientációban egy 192 bázispárból álló Xho II fragmentumot tartalmazó kiónt azonosítottunk, a plazmid 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
