201682. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina előállítására
3 HU 201 682 B 4 egységet tartalmaznak, és azok N-terminális végéhez az NS1 N-terminális 81 aminosavja van fuzionálva; RG polipeptidek, .amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy glicin-aminosavmaradék kapcsolódik; RLA polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy leucin-arginin aminosav-maradék kapcsolódik; RN polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez egy Asn-Thr-Val-Ser-Ser- szekvencia kapcsolódik. A CS-protein ismétlődő egységeket genetikailag kódoló szekvenciát ismert módon állítjuk elő, például szintézissel; vagy, előnyösebben, P. falciparumból a mRNS reverz transzkripciójával, például Ellis és munkatársai [Nature 302, 536 (1983)] módszerével; vagy a P. falciparum genom DNS-éből származó érintetlen gén közvetlen klónozásával, például Dame és munkatársai fent idézett módszere szerint Az la. ábra a CS-proteint kódoló régiót szemlélteti. A P. falciparumot és annak sporozoitjait fertőzött emberből vagy moszkitóból nyerhetjük. A CS-proteint vagy annak egy részét kódoló szekvencia klónozása után ismert módon előállíthatjuk annak egy al-fragmentumát, amely az ismétlődő egységet vagy annak egy részét kódolja. A CS-protein génben lévő megfelelő hozzáférhető restrikciós helyeket az la. ábrán szemléltetjük. Előnyösek az Xho II helyek. Az Xho II-vel végzett hasítással egy N-Asp-Pro-[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-ProjJn-C képletű, 16 ismétlődd egységet kódoló szekvencia válik szabaddá, a fenti képletben n értéke 1. Több tandem Xho II fragmentumot a megfelelő orientációban használva hosszabb ismétlődő egységeket kapunk, azaz a fenti képletben n értéke 1-nél nagyobb lesz. A szintetikus eljárások jól ismertek, és kereskedelmi forgalomban lévő DNS-szintetizátorok alkalmazásával végrehajthatók. Szintézissel előállítható olyan oligonukleotid, amely lényegében a fenti aminosavaknak megfelelő kodonokat tartalmazza, és ugyanazon Xho II végeket vagy más hasítási helyeket tartalmaz a végeken. A fenti szintetikus oligonukleotidok eltérhetnek a természetes 64 kodontól, és vagy ugyanezen aminosavakat kódolhatják, vagy egy olyan polipeptidet, amelyben kis számú, előnyösen kb. nyolcnál kevesebb eltérő aminosav van, feltéve, hogy ezzel a polipeptid immunológiai védőképessége nem csökken jelentősen. A szintetikus kódoló szekvencia például a teljes működő szekvenciát kódolja, amelynek képlete (-Asn-Ala-Asn-Pro-)n. és n értéke legalább 16. Apolipeptidetkódoló szekvenciát egy E. coli expreszsziós vektorba illeszthetjük, amelyek többsége ismert és hozzáférhető. A találmány szerinti polipeptidek magas szintű expressziója E. coliban meglepő, a termék szokatlan aminosav-összetétele - kb. 50% aszparagin, 25% alanin és 25% prolin - miatt. Mint azt alább ismertetjük, tapasztalataink szerint a kódoló szekvencia jól expresszálható a lambda PL promoteréből és a lambda eil riboszoma-kölőhelyéből álló regulátor elem használatával, amint azt a pASl plazmid tartalmazza [Rosenberg és munkatársai: Meth. Enzym. 101,123 (1983) és Shatzman és munkatársai: Experimental Manipulation of Gene Expression, szerk. M. Inouye, Academic Press, New York, 1982], A pASl hordozza a replikádé pBR322 eredetét, egy ampicillin-rezisztencia markért, és a lambdából származó fragmentumok sorát, beleértve a PL-t, N-antiterminációs funkciójú felismerő helyeket (NutL és NutR), az rho-függő transzkripciós terminációs szignált (tRl) és a cll riboszoma-kötőhelyet, amely magában foglalja a cll transzlációt iniciálé helyet, amelynek G-maradékát közvetlenül egy Bam Hl hasítási hely követi. A pASl a pKC30cII-ből származtatható oly módon, hogy a pKC30cII cII-pBR322 csatlakozásánál lévő Bam Hl hely és a cll ATG közötti nukleotidokat töröljük, és a molekulát újra összekapcsoljuk, hogy a Bam Hl helyet közvetlenül az ATG-től lefelé regeneráljuk. A pKC30cII-t úgy szerkeszthetjük meg, hogy a lambda 1.3 kg-ból álló Hae fragmentumát - amely a cll gént hordozza - a pKC30 Hpa I helyébe illesztjük, Rosenberg és munkatársai, illetve Shatzman és munkatársai fent idézett módszerei szerint. A pKC30-at Shimitake és munkatársai [Nature 292, 128 (1981)] ismertették, ez egy pBR322 származék, amely a pBR322 tetR génjében a Hind III és Bam Hl helyek közé illesztve egy 2.4 kg-ból álló lambda Hind III-Bam Hl fragmentumot tartalmaz. A pASl-hez hasonló szerkezetet ismertettek Courtney és munkatársai [Nature 313, 149 (1985)] is. A pASl az American Type Culture Colection-nél (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) van letétbe helyezve, ATCC 39262 számon. A találmány szerinti expressziós vektort úgy állítjuk elő, hogy a kódoló szekvenciát működőképes helyzetben - azaz helyes orientációban és megfelelő leolvasási rendben - ismert módszerrel egy E. coli expressziós vektor regulátor eleméhez kötjük. A fenti módon kifejeződött polipeptidet a szokásos fehérje-elválasztási módszerekkel választjuk el és tisztítjuk az azt termelő tenyészetből. A tisztítást például az alábbi lépésekből álló eljárással végezhetjük: 1. a sejteket elroncsoljuk, 2. a sejt-törmeléktől megtisztítjuk a rendszert, 3. a találmány szerinti eljárással előállított polipeptideket elválasztjuk a megtisztított sejt-extraktumban lévő egyéb polipeptidektől, 4. a maradék szennyeződést, így a maradék polipeptidet, szénhidrátot, nukleinsavat és/vagy lipopoliszacharidot egy befejező tisztítási művelettel eltávolítjuk. Az első lépést úgy hajthatjuk végre, hogy például lizozimet vagy más lizáló vagy permeabilizáló szert adunk a rendszerhez, vagy a sejteket mechanikusan vagy ultrahangos kezeléssel roncsoljuk el. Az extraktum tisztítására szolgáló centrifugálás vagy ultraszűrés előtt felületaktív szert adunk a rendszerhez, a találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek oldatban tartására. A találmány szerinti eljárás egyik lényeges elemét az a felismerés képezi, hogy a találmány szerinti eljárással előállított bizonyos polipeptideket úgy választhatjuk el igen nagy hatékonysággal az egyéb polipeptidektől, ha a tisztított extraktumot a protein oltatban tartására adott detergens beadagolása után közel 80 'C-ra melegítjük. Azt tapasztaltuk, hogy ha az extraktumot 80 *C-on legalább 4 percen át melegítjük, csaknem az összes bakteriális polipeptid kicsapódik, anélkül, hogy a lényegében az ismétlődő egységekből álló, vagy az isméüődő egységek más, nem hőre denaturálódó szekvenciákhoz való kapcsolódásából álló polipeptidek denaturálódnának. A denaturált bakteriális polipeptideket centrifugálással tömöríthetjük és eltávolíthatjuk. A fenti eljárás az Rtet32, RG, RLAés Rtetgí polipeptidek tisztítására használható. Közelebbről, a fenti eljárást sikeresen alkalmaztuk az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
