201680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású szinergetikus gyógyszerkészítmény előállítására
1 HU 201 680 A 2 A találmány tárgya eljárás tisztított humán tumorellenes anyagot (továbbiakban hTNF), és humán interferont (továbbiakban hIFN) tartalmazó, humán tumorok kezelésére alkalmas szincrgetikus gyógyszerkészítmények előállítására. Több, mint egy évszázada fedezték fel, hogy bizonyos bakteriális fertőzések során a fertőzött emberben jelenlévő tumorok egyidejűleg visszafejlődnek, in vivo. Ezzel a felfedezéssel kezdődött a tumor nekrózis faktornak (TNF) nevezett tumorellenes anyag kutatása. Coley és mások is több, mint 40 éven át kezelték a humán rosszindulatú daganatokat bakteriális eredetű sejtmentes szűrletekkel vagy vegyes bakteriális vakcinákkal, gyakran pozitív eredménnyel. Tengerimalacokkal és egerekkel is végeztek kísérleteket. A tumorellenes hatás a fenti kísérleti állatokban súlyos vérzéses reakcióban nyilvánul meg a tumor magjában, a bakteriális kezelést követő 4 órán belül. Ezt követően lassabb, nekrotizáló hatás figyelhető meg, amelynek intenzitása a következő 48 óra alatt növekszik. A tumor színe egyre erősebben sötétedik, ami elhalásra és vérzésre utal, és sok esetben a tumor teljes visszafejlődését eredményezi. A fenti meglepő vérzéses elhalást - amely bizonyos kísérletes tumorok esetén Gram-negatív baktériumokkal vagy azok sejtfalából származó lipopoliszacharid természetű endotoxinokkal idézhető elő - már régóta a fentebb említett klinikai megfigyelések kísérleti megfelelőjének tekintik. A Sloan-Kettering Intézetben végzett kutatások azonban arra utalnak, hogy a bakteriális stimulálás hatására egy - feltehetően makrofág eredetű - anyag válik szabaddá, amely közvetlenül vagy közvetve maga felelős a tumorölő hatásért. Bizonyíték erre az a kísérlet, amelyben kimutatták, hogy a BCG-vel fertőzött, endotoxinnel injektált egerek széruma vérzéses nekrózist okoz transzplantált Meth A szarkóma sejteken és más tumorokon. Ugyanakkor a BCG-vel fertőzött egerek, vagy az endotoxinnal kezelt fertőzetlen egerek széruma hatástalan. Az endotoxin önmagában a legtöbb tumorsejtre nézve nem toxikus, in vitro kísérletekben. A hatásos szérum-komponenst nevezik tumor nekrózis faktornak (továbbiakban TNF-nek). A TNF aktivitást nem lehet a maradék endotoxinnak tulajdonítani, amelyet az endotoxin-maradék meghatározására alkalmas pirogén hatás, Limulus teszt és kémiai analízis segítségével mértünk. A TNF - eltérően az endotoxintól - in vitro közvetlenül toxikus bizonyos tumorsejtekre; a normális eredetű, tenyésztett sejtek nem károsodnak [Lloyd, J. Old: New Developments in Cancer Therapy, MSKCC Clinical Bulletin 6, 118 (1976); E. A. Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72, 3666-70 (1975)]. Egyéb rágcsálók - például patkányok és nyulak - is termelnek TNF-et, BCG- és endotoxin kezelés hatására. A TNF-et először elsődlegesen BCG-vel (Bacillus Calmette Guérin) indukált, majd 2-3 hét múlva E. coliból származó endotoxinnal provokált egerek szérumában találták meg. önmagában sem a BCG, vagy annak alább ismertetett megfelelői, sem az endotoxin hatására nem jelenik meg TNF az egérszérumban, mind a kettőnek jelenlétére szükség van. A BCG helyett a retikuloendoteliális rendszerben a BCG-hez hasonlóan erős makrofág vagy egyéb celluláris elem szaporodást kiváltó Corynebacterium granulosummal, Corynebacterium Parvummal, maláriával vagy Zymosan-nal (élesztő sejtfal) is indukálhatjuk a TNF felszabadulást egérben. Ezek a BCG megfelelői. A BCG és endotoxin kezelés utáni szérum a szokásostól eltérő annyiban, hogy nem alvad meg teljesen. Egérben a TNF optimális termelését és annak vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük: a) BCG: 2 x 107 élő BCG-sejtet tartalmazó inokulummal érjük el a retikuloendoteliális rendszer (RÉS) maximális stimulálását és a szövetszaporodást b) endotoxin: 14-21 nap múlva, mikor a BCG-vel kiváltott RES-stimulálás a legnagyobb, 0,25-25 |ig endotoxint (E. coliból származó lipopoliszacharidot) adunk az egereknek, a legnagyobb TNF-szint a legnagyobb dózissal érhető el. c) TNF kinyerése: az optimális időpont 2 órával az endotoxin kezelés után van (későbbi időpontok kevésbbé jók a sokk által kiváltott keringési elégtelenség miatt) d) TNF vizsgálata: 1. In vivo A TNF-pozitív egérszérum nekrotizáló hatását (BALB/c x C57 BL/ö^ hibridbe transzplantált BALB/c Meth A ascites sarcomán vizsgáljuk, a következők szerint. Hét nappal a tumor szubkután transzplantálása után in vivo megvizsgáljuk a TNF- pozitív szérum hatását a transzplantátumra, a hatást vizuálisan értékeljük 24 órán át. Reakció először 3-4 óra elteltével észlelhető. 7 napos transzplantátumban a nekrotikus válaszreakció általában a beadott 0,1- 0,5 ml TNF-pozitív szérum térfogatának felel meg. A +++ erősségű reakció azt jelenti, hogy a tumor teljesen, vagy majdnem teljesen elpusztult, és a látszólag élő tumoros szövetből csak egy gyűrű marad vissza. A 6 napos transzplantátumok kevésbbé érzékenyek, az 5 naposok egyáltalán nem reagálnak. 2. In vitro A TNF-érzékeny L-M sejteket az American Type Culture Collection-lól származó klónozott egér L929 sejtekből nyertük. Az L-sejtek TNF-rezisztens sejtvonalát úgy állítottuk elő, hogy a TNF-érzékeny L- sejteket többször átoltottuk TNF-et tartalmazó táptalajba. A TNF a TNF-érzékeny L-sejtekre [L(S)] citotoxikus hatást fejt ki, míg a TNF-rezisztens L-sejtekkel [L(R)] szemben nem citotoxikus. A vizsgálatot 24 lyukú Costar lemezen végezzük. A lyukakba 50 000 tripszinezett L-sejtet tartalmazó 0,5 ml Eagle-féle minimál táptalajt mérünk, majd 2-3 óra múlva a TNF-et sorozathígításban tartalmazó táptalajból hozzámérünk 0,5 ml-t. 48 óra elteltével fázismikroszkópos vagy tripán-kék festék kizárásos értékelés segítségével meghatározzuk az 50%-os sejtpusztulást okozó protein mennyiségét. Például egy standard sarzsra 1 egység részlegesen tisztított egér TNF 58 ng vagy 20 000 egység/mg specifikus aktivitású proteinnek felel meg. A fenti részlegesen tisztított egér TNF nem tartalmaz IFN-t. A tisztítás előtti eredeti szérumban még van kevés interferon (IFN). A BCG helyett indukálószerként C. granulosumot, C. parvumot, maláriát vagy Zymosan-t (élesztő sejtfal) is használhatunk. Green és munkatársai [J. Nat. Cancer Inst. 59,1519 (1977)] szerint az egerekben az endotoxinnal szembeni maximális hiperszenzitivitás a C. parvum injektálása után hat nappal érhető el. Ennek megfelelően a fenti eljárás esetén az endotoxint 4 nappal a C. parvum beadása után adjuk az állatoknak. Az endotoxin dózisa 0,25 |ig, de a TNF felszabadításának foko5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
