201680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású szinergetikus gyógyszerkészítmény előállítására
3 HU 201 680 A 4 zására 25 pg mennyiségben használjuk. A maximális TNF-felszabadulás 1 pg endotoxin intravénás beinjektálása után 90 perccel figyelhető meg. A TNF-termelés különböző egértörzsek esetén különböző mértékű. Jelenlegi ismereteink szerint a TNF in vivo felszabadítására a Gram-negatív baktériumokból - például E. coliból - származó endotoxinok a legalkalmasabbak [Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72, 3666 (1975)]. A TNF hatása számos tumor (egér) rendszerben megfigyelhető, közelebbről az S-180 (CD-I Swiss), BP8 (C3H) szarkomákon; EL4 (C57B1/6), ASL1 (A törzs), RADA-1 (A törzs) és RL01 (BALB/c) leukémiákon; vagy P815 (DBA/2) masztocitómán. A Meth A erősen érzékeny a TNF-re abban az esetben, ha a tumort intradermálisan injektáltuk, mint azt az in vivo vizsgálatnál leírtuk. Kevésbé érzékenyek az alábbi tumorok: RCS5 (SJL) retikulum-sejt szarkóma rezisztensnek mutatkozott; a (C3H/An x I) Fi emlőtumorok csak kis mértékben érzékenyek, és az AKR spontán leukémiák közepesen érzékenyek a TNF-fel szemben. Fentiek szerint az egér TNF egér-tumorokkal szembeni terápiás hatása nyilvánvaló [Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72,3666(1975)]. In vitro a transzformált rágcsáló fibroblasztok (L-sejtek) szövettenyészetben sokkal érzékenyebbek voltak TNF-fel szemben, mint a Meth A szarkóma sejtek vagy az egérembrió fibroblasztok (MEF). Az élő sejtszámot 48 órás TNF-es kezelés után határozzuk meg. A hatás citotoxikus és citosztatikus, de késleltetett, mivel az első 16 órában nem figyelhető meg. Az in vivo hatás Meth A sejten egy nekrotikus folyamat, amely a Meth A tumor középpontjából kiindulva kifelé teljed, és a látszólag változatlan tumorszövetből csak egy gyűrű marad vissza. A visszamaradt tumorszövetből a tumor újra kifejlődhet Optimális dózisú TNF-fel végzett kezelés hatására a kezelt állatok nagy százalékában teljes visszafejlődés észlelhető. Az in vitro vizsgálat alapját az L-sejtekkel végzett vizsgálatok képezik, mint azt fentebb leírtuk. Rezisztens L-sejtvonalat is kitenyésztettünk, oly módon, hogy a TNF-érzékeny L-sejteket többször átoltottuk TNF-et tartalmazó táptalajba. A TNF citotoxikus és érzékeny L-sejtekre [L(S)], a rezisztens L-sejtekre [L(R)] azonban nem. A fenti vizsgálatokat is felhasználtuk a hTNF jellemzésére. A vizsgálatokból közvetett módon arra következtethetünk, hogy a TNF egyik sejtforrását a makrofágok képezik egér és nyúl esetén, mivel a BCG - vagy annak megfelelői - és endotoxin hatására a máj- és lép-makrofágok erőteljes szaporodásnak indulnak. összegezve: 1. a TNF-felszabadulást indukáló szerek erőteljes makrofág-szaporodást okoznak; 2. a BCG-vel előkezelt egerekben röviddel az endotoxin beinjektálása után megfigyelhető a lép-makrofágok szelektív lízise; 3. a TNF-et tartalmazó szérum lizoszomális eredetű enzim-tartalma magas, és az aktivált makrofágok jellemző módon sok lizoszomát tartalmaznak. A klónozott egér histiocitoma sejtvonalak (J774 és PU5-1.8) TNF-et termelnek; ez a termelés endotoxin hatására jelentős mértékben fokozódik Mannel és munkatársai [Infect. Immun. 30,523 (1980)] és Williamson és munkatársai nem publikált megfigyelései szerint. Az egér TNF, szérumból izolált formájában egy glikoproteint, amelynek legalább két, egy 40-60 000 és egy 150 000 molekulasúlyú formája van [Mannel és munkatársai: Infect. Immun. 28, 204 (1980); Kuli és munkatársai: J. Immunoi. 126, 1279 (1981); Haranaka K. és munkatársai: Jpn. J. Exp. Med. 51, 191 (1981); Green S. és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. USA 73, 381 (1976,) és nem publikált eredmények]. A TNF fagyasztott állapotban, előnyösen -70 'C alatt stabil. Aktivitását 70 *C-on 30 perc alatt elveszti. Nyulakban 5-500 pg/kg dózistartományban pirogén (lázkeltő) hatást fejt ki, 5 pg/kg dózisban nem lázkeltő. A nyúl TNF molekulasúlya irodalmi adatok szerint 39 000 és 68 000 közötti tartományban van [Ruff M. R. és munkatársai: J. Immunoi. 125,1671 (1980); Matthews N. és munkatársai: Br. J. Cancer 42, 416 (1980); Matthews N. és munkatársai: Brit J. Cancer 38,302 (1978); Ostrove J. M. és munkatársai: Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 160,354 (1979) ]. A protein-természetű interferon a gazdaállatokban előzetes vírusfertőzés eredményeként termelődik. A képződött interferon védi a gazdaállatot egy későbbi vírusfertőzéssel szemben. Az interferonnak (IFN) bizonyítottan fontos szerepe van az immunszabályozó rendszerben. Az interferon a vizsgálatok szerint a következő sejt-funkciókra hat: gátolja a sejtosztódást, a tumor növekedést, antitest-képződést, eritroid differenciálódást és adipocita differenciálódást, és serkenti a makrofág fagocitózist, limfocita toxieitást, NK sejt aktivitást, sejt felületi antigén kifejeződést és antitest termelést. Újabb eredmények szerint az IFN rákellenes szerként is szóbajöheL Három fő interferon típus van, mégpedig az alfa-, béta- és gamma-IFN, melyek egymástól antigén és biokémiai tulajdonságaikban különböznek. Az alfa-IFN-t a fehérvérsejt leukociták választják ki, a béta-IFN-t a fibroblasztok, és mindkettőt virálisan lehet indukálni. A gamma-IFN-t a limfoid sejtek választják ki, és mint immun-interferon ismert [Stewart W. E. II és munkatársai: Nature 286, 110 (1980)]. A fenti három IFN-típus megkülönböztetése elsősorban az antigén tulajdonságok nagyfokú eltérésén alapul. Ezen kívül az INF-ek számos biológiai és fizikai-kémiai tulajdonságukban különböznek. A humán alfa- és béta-INF-t már sikerült megtisztítani, és aminosav-szekvenciáját meghatározni, részben közvetlen aminosav-szekvencia meghatározási módszerrel [Knight E. Jr. és munkatársai: Science 207, 525 (1980); Zoon K. C.: Science 207, 527 (1980)], és még teljesebben a klónozott komplementer DNS-szekvencia meghatározásával [Mantei N. és munkatársai: Gene 10,1 (1980); Taniguchi T. és munkatársai: Gene 10,11 (1980)]. A klónozott alfa-és béta-IFN DNS-szek'venciákat összehasonlítva csak 29%-os egyezést találtak a két fajta interferon között, aminosav-szinten [Taniguchi T., Mantei, N. és munkatársai: Nature 285,547 (1980) ]. A fenti három fő interferon-típuson belül molekuláris alcsoportokat is megkülönböztethetünk, ezek között azonban kisebb fokú az eltérés. A klónozott DNS-szekvenciák összehasonlításának segítésével ezidáig számos alcsoportot felismertek már a humán alfa- IFN-en belül [Nagata S. és munkatársai: Nature 287,401 (1980)]. A gamma-IFN-ről sokkal kevesebbet tudunk. A gamma-IFN általában a mitogéneknek - például különféle lektineknek vagy az érzékenyített sejtek tenyészetében található, specifikus antigéneknek - kitett limfocita-tenyészetek felülúszőjában fordul elő. A gamma-IFN meghatározásának két fő kritériuma a következő: (i) az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
