201678. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán retrovírus elleni 3'-azido-3'-dezoxitimidin-származékokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
13 HU 201 678 B 14 11. példa (iníramuszkuláris injekció) aktív alkotórész 0,20 g benzil-alkohol 0,10 g glikofurol 75 1,45 gr víz az injekcióhoz, szükséges mennyiség 3,00 ml-re Az aktív alkotórészt glikofurolban oldjuk, majd benzil-akoholt adunk hozzá, oldjuk és vízzel 3 ml-re feltöltjük. Az oldatot steril mikropórusos szűrón szüljük és 3 ml-es barna steril fiolába (1 típus) töltjük és lezárjuk. 12. példa (Keverék) aktív alkotórész 0,2500 g szorbit-oldat 1,5000 g glicerin 2,0000 g nátrium-benzoát 0,0050 g ízesítő, peach 17.42.3169 0,0125 ml steril víz szükséges mennyiség 5,0000 ml-re Az aktív alkotórészt glicerinben és steril víz nagyobb részében oldjuk. Ezután a nátrium-benzoát vizes oldatát, majd a szorbit-oldatot, és végül az ízesítőanyagot hozzáadjuk. A térfogatot steril vízzel megfelelő térfogatra beállítjuk és jól összekeverjük. 13. példa (Szuppozitórium) mg/szuppozitórium aktív alkotórész (63 pm)+ 250 Bari Fát, BP (Witepsol H15- - Dynamit Nobel) 1770 2020 + az aktív alkotórészt, mint port használjuk, amelynek legalább 90%-a 63 pm átmérőjű vagy ennél kisebb. A Witepsol H15 egyötöd részét egy kettősfalú, gőzfűtéses edényben, max. 45 "C hőmérsékleten megolvasztjuk. Az aktív alkotórészt 200 pm-es szitán átszűrjük, az olvadt anyaghoz hozzáadjuk, elkeverjük és aprítjuk, míg egyenletesen sima diszperziót nem kapunk. A keveréket 45 'C hőmérsékleten tartjuk, a maradék Witepsol H15-ÖI a szuszpenzióhoz adjuk és egyenletesen homogén eleggyé elkeverjük. Az egész szuszpenziót egy 250 pm rozsdamentes acélszitán átengedjük és állandó keverés közben 40 *C hőmérsékletre hagyjuk lehűlni, majd 38-40 °C hőmérsékleten 2,02 g elegyet egy megfelelő műanyag öntőformába öntjük. 14. példa (Pesszárium) mg/pesszárium aktív alkotórész 63 pm 250 vízmentes dextróz 380 burgonyakeményítő 363 magnézium-sztcarát 7 1000 Ezeket az alkotórészeket közvetlenül összekeverjük, és a pesszáriumot az elegy közvetlen préselésével kapjuk. 15. példa Vírusellenes aktivitás a)i) Retrovirus okozta ártalom BALB/c nőstény egereknek, melyeket 1,5x10* mennyiségű Rauscher Murine Leukaemia Vírussal (RVB 3 törzs) fertőztünk, 3’-azido-3’-dezoxitimidint adagolunk. A kezelést a fertőzés után 4 órával 80 mg/kg intraperiténeális dózissal indítjuk és minden 8 órában azt, vagy orálisan, ivóvízben 0,5 mg/ml, vagy 1,0 mg/ml dózist adagolunk. Ilyen kezelésre azt találtuk, hogy a lép-sejt fertőzését és az ezt követő szplenomegália kifejlődését meggátolja, valamint a viremiát is elfojtja. ii) HTLV-l TM-11 sejtet (T-sejtklón HTLV-I fertőzésre érzékeny) besugárzott, HTLV-I termelő MJ-tumorsejttel együtt tenyésztjük a következő módon: a) TM-11 sejt egyedül; b) TM-11 sejt és MJ-tumorsejt; c) TM-11 sejt, MJ-tumorsejt és 3’-azido-3’-dezoxitimidin (3 uM/pmól); d) TM-11 sejt, MJ-tumorsejt és 3’-azido-3’-dezoxitimidin (9 uM/pmól); e) TM-11 sejt, MJ-tumorsejt és 3’-azido-3’-dezoxitimidin (27 uM/pmól). A 18. napon mindegyik tenyészetből a DNS-t extraháljuk, és a BamHl-el digeráljuk, hogy HTLV-I genóm fragments termeljen, mely bármely gazda-mellékszekvenciától mentes, és 3,3 kD standard molekulasúllyal rendelkezik. A digerálást ezután izotópjclzctt lambda-MT-2-vel vizsgáljuk, mely egy standard próba a HTLV-t BamHl framgensének felismerésére. Az a)-nál hibridizáció nem figyelhető meg, mely a nem fertőzött kontroliban a vírus hiányát jelzi. A b)-nél a nem kezelt, fertőzött kontrolinál erős jel látható. Gyenge jel vehető észre a c)-nél, mely a vírus nem tökéletes megsemmisítését jelzi, és a d)-nél vagy e)-nél hibridizáció nincs, mely a vírus teljes elpusztulását jelzi. Mindegyik tenyészetet T-sejt receptor béta-lánc próbára is megvizsgáltuk. Mindegyik tenyészetnél erős jel van, mely kísérlet közben a TM-11 folytonos jelenlétét mutatja. b)A1DV i) Reverz transzkriptáz aktivitás A 3’-azido-5’-trifoszfát-3’-dczoxitimidint in vitro AIDV transzkriptázzal (AIDV RT) teszteltük. Az AIDV RT-t pelletizált és extrahált AIDV-ből DEAE és foszfocellulóz oszlopokon eluálva tisztítottuk. Az enzimaktivitás 60 percen át lineáris és legalább két hónapig stabil, ha ml-ként 1 mg borjúszérum-albumint tartalmazó 60%-os glicerinben tároljuk. Template primerként rA-odT(12_18)-ot alkalmazva, az AIDV RT pH optimuma 7,0-7,3, MnCl2 optimuma 0,3 mM és MgCl2 optimuma 5 mM. Az aktivitás 5 mMMgCl2 jelenlétében tízszer nagyobb mint 0,3 mM MnCl2 jelenlétében. 80- 140 mM KCl-nál, és 60-100 mM NaCl-nál szintén maximális enzimaktivitást találtunk. A fH) dTTP bevitele az enzimkoncentrációra vonatkoztatva lineáris volt. A tesztelésben a 3’-azido-5’-trifoszfát-3’-dezoxitimidint az AIDV RT kompetitiv inhibitorának találtuk, melynek Ki értéke 0,04 pM, ha tcmplate-primerként rA-odT(12_18)-at használunk. Az enzim a dTTp-re egy 2,81 pM km értékkel rendelkezik, gondolván azt, hogy a 3’-azido-5’-trifoszfát-3’-dezoxitimidin erősebben kötődik az enzimhez, mint a dTPP. A madár-mieloblasztózis vírus, a Moloney murine leukaemia vírus és az AIDV RT-kel végzett további kísérletek azt mutatják, hogy a 3’-azido-5’-trifoszfát-dezoxitimidin a DNS lánchossz egy terminátora. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
