201658. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rovarirtó hatóanyag előállítására Bacillus thuringiensis var. israelensis fermentálásával
7 HU 201 658 B 8 30 naponként átoltva, kifejlődés után 4 °C-on tárolva, folyékony táptalajon bcspóráztatva és mélyhűtve. A szelektált törzsek tárolása előnyösen liofilezéssel valósítható meg. Találmányunk értelmében a diptericid-toxint termelő törzsek szelekcióját az alábbiak szerint végezzük. AB. thuringiensis var. israelensis I-TE 0020 sz. törzsből szubmerz tenyésztéssel spórás inokulumot állítunk elő 0,1-5,0 tömeg/térf.% szénhidrátot, előnyösen 1,5 tömcg% glükózt, mint egyedüli szénforrást, szerves bioszanyag forrást, előnyösen élesztőkivonatot, nitráttól eltérő szervetlen nitrogénforrást, előnyösen ammónium-szulfátot, szerves nilrogénforrást, előnyösen kazein hidrolizáiumot, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajon. pH: 5,0-8,0, előnyösen 7,0, tenyésztési hőmérséklet 18-30 'C előnyösen: 28 *C, inkubációs idő: 8-96 óra, előnyösen 32 óra. Az ily módon előállított spórás tenyészettel ismert módon, pl. hígítási sorozatból lemezöntéssel, jól elkülönülő telepeket állítunk elő 1,0-2,5 tömeg%, előnyösen 2 tömeg% agarral szilárdított táptalajon. Ez a táptalaj lehet a fentebbi összetétellel ismertetett, vagy más változat is, amellyel különböző táptalaj komponensek és paraméterek hatását kívánjuk vizsgálni az entomotoxikus komponencsekre. A szilárd táptalaj tenyészeteket 18-38 ‘C-on, előnyösen 28 °C-on inkubáljuk 12-96 óráig, előnyösen 48 óráig. Eljárhatunk úgy is, hogy a spórás inokulumot ismert módon mutagénekkel kezeljük. A kifejlődött telepeket a fentebb ismertetett összetételű agarral szilárdított, ferdített steril táptalajra kioltva szubkultúrákban fenntartjuk. Az entomotoxikus komponensek (delta-endotoxin kristály, spóra) vizsgálatánál az alábbiak szerint járunk el. A lemezöntésből kifejlődött telepekből, vagy azok szubkultúráiból szilárd, vagy szubmerz tenyészetükből kikent, tárgylemez preparátumot készítünk. Mikroszkópi készítményekhez használatos bázikus anilin festékkel, előnyösen 2 tömeg%-os, vizes malachit-zölddel festünk 2-6 percig, előnyösen 5 percig. Vizes mosás, szárítás után homogén immerziós rendszerben, mikroszkóppal, Köhler megvilágítással, Hl 100/1,3 x MFK 1: 5-1:10, előnyösen MFK 1 : 8 optikai rendszerrel vizsgálunk. Narancssárga fényszűrő (lambda = 0,55 |im) használata mellett a fenti optikai rendszer feloldó képessége A = 0,55/1,3 = 0,42 jtm, alkalmas az entomotoxikus komponensek (ovoid-kristály, spórák) azonosítására. Az eljárás szerint intenzíven festődik az ovoid-kristály, jól festődik a sejt, alig festődik a spóra. Eljárhatunk úgy is, hogy az optikai rendszerben kalibrált okulár négyzethálót is alkalmazunk, így megválasztott mintaréteg vastagság mellett megadható az egységnyi térfogatban észlelhető morfológiai elemek száma. A leírtak szerint eljárva a szelekció első lépésénél (a lemezöntésből kifejlődött telepek) mellőzhetők azok a változatok, amelyek ovoid-kristályt és/vagy nem termelnek, így diptericid hatással nem rendelkeznek. A termelő szubkultúrákban, különösen előnyösen a szubmerz tenyészetekben, folyamatosan nyomon követhető az ovoid toxinkristály és/vagy spóraképződés. Az ily módon szelektált törzseket használjuk a diptericid hatású biomassza fermentációs úton történő előállítására. A B. thuringiensis var. israelensis I-TE 0020 törzsből szubmerz tenyésztéssel inokulumot 0,1-5,5 tömeg/térf.% szénhidrátot, előnyösen 1,0 tömeg% glükózt, nitráttól eltérő szervetlen nitrogénforrást, előnyösen ammónium-szulfátot, szerves nitrogénforrást, előnyösen fehérje hidrolizátumot, természetes bioszanyag forrást, előnyösen élesztőkivonatot, valamint szerveden sókat tartalmazó táptalajon, pH: 5,0-8,0, előnyösen: 7,0. Tenyésztési hőmérséklet: 18-38 *C, előnyösen 28 *C. Inkubációs idő 8-96 óra, előnyösen 48 óra. Az ily módon előállított inokulummal 0,5-5,0 térf.%, előnyösen 1,0 térf.%-kal oltjuk a 0,5-8,0 tömeg/térf.% vízoldható szénhidrátot, előnyösen 2,0 tömcg/térf.% enzimmel folyósított kukorica őrleményt, 0,5-5,0 tömeg/térf.% szerves nitrogénforrást előnyösen 2,0 tömeg/térf.% enzimmel hidrolizált szójadarát, természetes bioszanyag forrást, előnyösen élesztőkivonatot, valamint szerveden sókat tartalmazó táptalajt. pH: 5,0- 8,0, előnyösen 7,0. Tenyésztési hőmérséklet: 18-38 *C, előnyösen 28 ‘C. Levegőztetés: 0,5-2,0 v/v/min, előnyösen 1,0 v/v/min. Kevertetés: 200 n/min-600 n/min, előnyösen 400 n/min. Fermentációs idő: 8-96 óra, előnyösen 36 óra. A diptericid hatóanyag produkciót az ismertetett mofrometriai és/vagy biológiai teszttel Aedes acgyptin (L 3rd st.) értékeljük. Aktivitás: (M% = mortalitás 48 óra alatt) [Entomophaga, Tom. II, No.2 101-159 (1962)]; Hígítás: M% (48 óra) 1:5 100 1:25 100 1:125 100 ALC9S: 0,8 ml/5 ml, (24 óra expozíció) 0 desztillált víz A kapott fermenüevet szűréssel és/vagy centrifugálással betöményítjük, adott esetben tartósítjuk, nedvesítő, emulgcáló, ragasztó, hővédő, fényvédő anyagokkal ismert módon formáljuk, sűrítménynek, vagy pasztának, adott esetben porrá alakítjuk, permetező vagy porozószerként Dipterák ellen használjuk. Hatóanyag 20- 35 billió spóra és ovoid-kristály/g. Hatékony dózis: 0. 5-5,0 kg/ha, a cél állattól és az applikációs feltételektől függően. A találmányunk szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa A B. thuringiensis var. israelensis I-TE 0020 (Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteménye, NCAIM B 001023) törzs tripton-glükóz-élesztőkivonat (TGE) 7 napos ferde agar tenyészetéről 0,02 tömeg%-os Twcen-80 (oxi-etilezett anhidroszorbit-monooleát) steril oldattal spóra szuszpenziót készítünk. A spóra szuszpenzió 2-2 ml-ével rázott tenyészetet készítünk az alábbi összetételű táptalajon: MgS04.7H20 0,3 g FeS04 . 7H20 0,02 g ZnS04 . 7H20 0,02 g MnS04.4H20 0,05 g K2HP04 0,5 g CaC03 1,0 g Tripton (DIFCO) 5,0 g Pepton (Witte) 2,0 g Élesztőkivonat (DIFCO) 2,0 g Glükóz 15,0 g Desztillált víz 1000 ml pH: 7,0 Dozirozás: 50 ml/300 ml E. lombik Sterilezés: 30 perc, 0,981. KfPa 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
