201658. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rovarirtó hatóanyag előállítására Bacillus thuringiensis var. israelensis fermentálásával
9 HU 201 658 B 10 Inkubációs hőmérséklet 28 *C. Fordulatszám: 250 n/min. Inkubációs idő: 36 óra. A tenyészetben gyakorlatilag spórákat találunk 10* - lO’/ml nagyságrendben. A spórás tenyészetből 0,02 t/% Tween 80 steril oldatával hígítási sorozatot készítünk 109 léptékig. 103 * * 6 5 hígítástól 5-5 párhuzamossal bekevert lemezöntéseket készítünk a fenti összetételű táptalaj 2,0 \J% agar-agarral szilárdított változatán. A lemezeket 28 ‘C inkubáljuk 48 óráig. A kifejlődött telepeket kioltjuk tripton-glükózélesztőkivonat ferde agarra 28 'C-on 48 óráig inkubál- 10 juk, majd a tenyészeteket+4 *C-on tároljuk. A telepekből a kioltással párhuzamosan kikent szárított tárgylemez készítményt állítunk elő. A 2 tf%-os, vizes malachit-zölddel agresszív festést végzünk 4 percig. Vizes mosás, szárítás után homogén immcrziós rend- 15 szerrel, Hl 100 X MFK1: 8 optikával, Köhler megvilágítással vizsgálunk. A készítményekben intenzíven festődik az ovoid dclta-endotoxin kristály, jól festődnek a vegetatív sejtek, alig festődnek a kiszabadult spórák. A mikroszkópi kép alapján elvégezzük a szelekciót 20 az asporogén toxinkristályt nem termelő szubkultúrákat nem tartjuk fenn. A jól spórázó, delta-endotoxin kristályt termelő vonalakat rázott, szubmerz tenyészetben ellenőrizzük diptericid aktivitásra. 25 2. példa Az 1. példa szerint rázott szubmerz tenyésztéssel spórás inokulumot állítunk elő a B. thuringiensis var. israelensis I-TE 0020 törzs jól spórázó, toxinkristályt 30 termelő szelektált szubkultúrájából. A spórás inokulum 2-2 ml-ével az alábbi összetételű rázott tenyészetet oltjuk. MgS04 . 7H20 0,3 g FeS04 . 7HjO 0,02 g 35 ZnS04 . 7HjO 0,02 g MnS04 . 4H20 0,02 g K2HP04 0,5 g CaCOj 3,0 g Szójaliszt (extrahált, pörkölt) 10,0 g 40 Élesztőkivonat (DIFCO) 2,0 g Pepton (Witte) 2,0 g Glükóz 15,0 g Desztillált víz 1000 ml pH: 7,0 45 Dozirozás: 50 ml/300 ml Erlenmayer-lombik Sterilezés: 1 at, 30 perc Inkubációs hőmérséklet: 28 ± 1 °C Fordulat: 250 n/perc 96 óra fermentáció után az Aedes aegyptivel (L 3rd st.) 50 elvégzett biológiai teszt eredménye: Hígítás: M% (48 óra) 1:5 100 1:25 100 1:125 100 55 ALC,5.0,8 ml/5 ml (24 óra expozíció) 0 desztillált víz 3. példa Az 1. példa szerint rázott szubmerz tenyésztéssel 60 spórás inokulumot állítunk elő a B. thuringiensis var. israelensis I-TE 0020 törzs jól spórázó toxinkristályt termelő szelektált kultúrájából. A spórás inokulum 2- 2 ml-ével oltjuk az alábbi összetételű rázott szubmerz tenyésztéshez szolgáló táptalajt: 65 NaCl 5,0 g MgS04 . 7H20 0,1 g CaCl2 0,5 g Tripton (DIFCO) 20,0 g Élesztőkivonat (DIFCO) 40,0 g Glükóz 5,0 g Desztillált víz 1000 ml pH: 7,2 Dozirozás: 50 ml/300 ml E. lombik Sterilezés: 1 at, 30 perc Inkubációs hőmérséklet: 28 ± 1 *C Fordulat: 250 n/perc 96 óráig megfigyelt fermentáció után az Aedcs aegyptivel (L 3rd st.) elvégzett biológiai teszt eredménye: Hígítás: M% (48 óra) 1:5 100 1:25 100 1: 125 100 ALG,j. 0,8 ml/5 ml (24 óra expozíció) 0 desztillált víz 4. példa Az 1. példa szerint rázott szubmerz tenyésztéssel spórás inokulumot állítunk elő a B. thuringiensis var. israelensis I-TE 0020 sz. törzs jól spórázó toxinkristályt termelő szelektált szubkultúrájából. A spórás inokulum 2-2 ml-ével oltjuk az alábbi összetételű táptalajt: MgS04 . 7H20 0,3 g FeS04 . 7H20 0,02 g ZnS04 . 7H20 0,02 g CaC03 1,0 g Tejpor, sovány 10,0 g Desztillált víz 1000 ml pH: 7,0 Dozirozás: 50 ml/300 ml Erlenmayer-lombik Sterilezés: 30 perc, 0,981. ÍO’PA Inkubációs hőmérséklet: 28 ± 1 *C Fordulat: 250 n/perc 96 óra fermentáció után az Aedes aegyptivel (L 3rd st.) elvégzett biológiai teszt eredménye: Hígítás: M% (48 óra) 1:5 100 1:25 100 1:125 100 ALC95.0,8 ml/5 ml (24 óra expozíció) 0 desztillált víz 5. példa Az 1. példa szerint rázott szubmerz tenyésztéssel spórás inokulumot állítunk elő a B. thuringiensis var. israelensis I-TE 0020 sz. törzs jól spórázó, toxinkristályt termelő szelektált szubkultúrájából. A sterilen összefejtett inokulum 80 ml-ével oltjuk a BIOTECH-FL110 tip. 10 literes laboratóriumi fermentorba előkészített steril táptalajt, melynek összetétele: MgS04 . 7H20 0,4 g FeS04 . 7H20 0,02 g ZnS04 . 7H20 0,02 g MnS04 . 4H20 0,02 g CaC03 4,0 g (NH»)2S04 2,0 g Szójaliszt 20,0 g Kukoricaliszt 30,0 g Csapvíz 1000 ml A növénykomponenseket 30 tömcg%-os vizes szusz-6
