201658. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rovarirtó hatóanyag előállítására Bacillus thuringiensis var. israelensis fermentálásával
5 HU 201 658 B 6 Yousten, A. A.: 1979. In: „Microbial Biomass” (A. A. Rose, ed.) Acad, Press New York], A 3 073 749 USA szabadalom (Megna, J. C., 1963) szubmerz fermentációval történő B. thuringiensis biomassza előállítását ismerteti. Mind az inokulum táptalajokban, mind pedig a termelő táptalajban répamelaszt használ szénforrásnak, szárított kukorica lekvárt, illetve gyapotmag lisztet nitrogénforrásként. Bár a batch-rendszerű szubmerz fermentáció lényegesen előnyösebb, mint az SSF eljárás, az egyszeri töltéssel adagolt mintegy 50 g/L tápanyag célszerű hasznosulása vitatható. A szacharózkeményítő szénforrások egyidejű jelenléte elég jelentős diauxiához vezethet. A tenyészet szinkronizálása alig megoldható. A 3 087 865 USA szabadalom (Drake and Smythe, 1963) olyan B. thuringiensis szubmerz tenyésztési eljárást ismertet, amely 6-12 tömeg% összes bevitt tápanyagot alkalmaz. A B. thuringiensis szaporodási és enzimaktivitásának ismeretében nehezen képzelhető el ennyi szén és nitrogén forrás célszerű felhasználása batchrendszerben. A Szovjetunióban a VASZHNIL dolgozott ki több entomocid készítmény előállítására vonatkozó eljárást eltérő producensekkel és némileg különböző táptalajokkal (Quinlan, R. J. Lisansky, S. G.: 1983. Microbial insecticides. Biotechnology. Vol. 3. Verlag Chemia, Basel. 233-254.). A CH 652 890 sz. szabadalom (Concannon, J. N„ 1978) rovarok és lárváik ellen ható MCA anyag felhasználásiával készült inszekticid készítmény előállítására vonatkozik. A használt biomasszát azonban egy Micrococcus pseudoflaccidifcx ATCC 31970 tenyészettel állítják elő. Az említett eljárások nem a találmányunk szerinti célt valósítják meg. A találmányunk szerinti eljárás célja stabilan diptericid hatású bacillus metabolit előállítása, amely alkalmas élőhelyeiken diptera lárvák, különösen szúnyoglárvák megsemmisítésére. Találmányunk alapja az a felismerés, hogy a B. thuringiensis var. israelensis törzsek által termelt szabálytalan alakú, vagy ovoid delta-endotoxin kristály és spóráik szelektív festéssel, fénymikroszkópos vizsgálattal láthatóvá és azonosíthatóvá tehetők, ismert térfogatban mennyiségileg is vizsgálhatók. Találmányunk alapja továbbá az a felismerés, hogy a láthatóvá tett entomotoxikus struktúrák vizsgálatával elvégezhető a B. thuringiensis var. israelensis törzsek spontán vagy indukált mutációs szelekciója, nyomon követhető a törzsfenntartás hatékonysága, a fermentációs elő és fő inokulumok használhatósága, a termelő fermentáció endotoxin és spóratermelő aktivitása. A találmányunk szerinti cél és eljárás az IMMNG., NCAIM B 001023 számon 1987. november 11-én letétbe helyezett Bacillus thuringiensis var. israelensis I-TE 0020 láb. törzzsel végzett szubmerz fermentációval valósítható meg. A törzs leírása: Az azonosítást a The Prokaryotes, ed. M.P., Starr et al., Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1981, valamint a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, The Williams and Wilcins Cr. Baltimore, 1974. VII. Ed. alapján végeztük el. Telepmorfológia: TGY agáron 72 órás petricsésze tenyészetben 4-8 mm átmérőjű gyengén kiemelkedő csontfehér sima telepek. Néha szektorban R telepek. HP levesben fehér zavarosodás, ülepedik, az üledék fonalas-nyálkás. Pigmentet nem képez. Gram: + Mikroszkópos morfológia: pálcák, lekerekített véggel, 0,8- 1,2pm x 3,0-5,0pm. Spóra: centrális, néha apikális 0,5 pm x 1,0-1,2 pm. Parasporális test: +, ovoid vagy szabálytalan, esetleg háromosztatú, közös és külön-külön is burokkal, d = 0,25-0,5 pm. Flagella: + Capsula: -Biológiai tulajdonságok: Savképzés: D-glükóz: + L-arabinóz: - D-mannit: -Gázképzés: D-glükóz: - Indok - Acetoin: - Kataláz: + Növekedés: pH: 5,7 + pH: 6,8 + Növekedés: NaCl 2 t%: + NaCl 5 t%: + NaCl 7 t%: + Növekedés: 5 °C: - 10 *C: + 30 "C: + 40 ‘C: + 50 ‘C: -Na-acetát bontás: + Na-formiát bontás: + Na-oxalát bontás: - Citrát bontás: + Dekerboxiláz: Omitin: - Lizin: - Arginin: + Eszkulin bontás: - Nitrát redukció: + V.P. próba: + Glükóz bontás: + Keményítő bontás: + Kazein bontás: + Zselatin bontás: + Szacharóz bontás: - Mannóz bontás: + Szalicin bontás: - Hemolizis: alfa, zöldülés Arginin hidroláz: + Urea bontás: -Diptericid, ovoid, szabálytalan alakú toxinkristályt termel. Fentiek alapján a törzs B. thuringiensis var. israelensis. A B. thuringiensis var. israelensis I-TE 0020 sz. törzs fenntartása megoldható az ismert módszerek bármelyikével, péld.: TGY-agaron, ferde tenyészetben, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
