201657. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rovarirtó hatóanyag előállítására Bacillus thuringiensis var. kurstaki fermentálásával
7 HU 201 657 B 8 tételű agarral szilárdított, ferdített steril táptalajra kioltva szubkultúrákban fenntartjuk. Az entomotoxikus komponensek (delta-endotoxin kristály, spóra) vizsgálatánál az alábbiak szerint járunk el. A lemezöntésből kifejlődött telepekből, vagy azok szubkultúráiból szilárd, vagy szubmerz tenyészetükből kikent, hővel fixált tárgylemez preparátumot készítünk. Mikroszkópi készítményekhez használatos festékekkel, előnyösen karbol-fukszinnal festünk 2-6 percig, előnyösen 4 percig. Vizes mosás, szárítás után homogén immerziós rendszerben, mikroszkóppal, Köhler megvilágítással, Hl 100/1,3 x MFK 1 : 5 - 1 : 10, előnyösen MFK 1 : 8 optikai rendszerrel vizsgálunk. Zöld fényszűrő (lambda = 0,5 pm) használata mellett a fenti optikai rendszer feloldó képessége A = 0,5/1,3 = 0,38 pm, alkalmas az entomotoxikus komponensek (dipiramid kristály, spórák) azonosítására. Az eljárás szerint intenzíven festődik a dipiramid kristály, jól festődik a sejt, alig festődik a spóra. Eljárhatunk úgy is, hogy az optikai rendszerben kalibrált okulár négyzethálót is alkalmazunk, így megválasztott mintarétegvastagság mellett, megadható az egységnyi térfogatban észlelhető morfológiai elemek száma. A leírtak szerint eljárva a szelekció első lépésénél (a lemczöntésből kifejlődött telepek) mellőzhetők azok a változatok, amelyek dclta-endotoxint és/vagy spórát nem termelnek így entomotoxikus hatással nem rendelkeznek. A termelő szubkultúrákban, különösen előnyösen a szubmerz tenyészetekben, folyamatosan nyomon követhető a delta-endotoxin és/vagy spóra képződés. Az ily módon szelektált törzseket használjuk az entomotoxikus hatású biomassza fermentációs úton történő előállítására. A B. thuringiensis var. kurstaki K-Cs 0019 törzsből szubmerz tenyésztéssel inokulumot készítünk 0,5-2,5 tömeg/térf.% szénhidrátot, előnyösen 1,5 tömeg% glükózt, szerves nitrogénforrást, előnyösen fehérjehidrolizátumot, természetes biosz anyagforrást, előnyösen élesztőkivonatot, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajon. pH: 5,0-8,0, előnyösen: 7,0. Tenyésztési hőmérséklet: 20-35 ’C, előnyösen 30 ‘C. Inkubációs idő: 8-72 óra, előnyösen 12 óra. Az ily módon előállított inokulummal 0,5-5,0 térf.%, előnyösen 1,0 térf.%-kal oltjuk a 0,5-8,0 tömeg/térf.%, vízoldható szénhidrátot, előnyösen 3,0 tömeg/térf.% enzimmel folyósított búzaörleményt, 0,5-5,0 tömeg/térf.% szerves nitrogénforrást, előnyösen 2,0 tömeg/térf.% enzimmel hidrolizált napraforgódarát, természetes bicszanyagforrást. előnyösen hidrolizált takarmányélesztőt, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajt. pH: 5,0-8,0, előnyösen 7,0. Tenyésztési hőmérséklet 20-35 "C, előnyösen 30 °C. Levegőztetés: 0,5-2,0 v/v/min, előnyösen 1,0 v/v/min. Kevertetés: 200 n/min-600 n/min, előnyösen 400 n/min. Fermentációs idő: 8- 96 óra, előnyösen 32 óra. Az entomotoxikus hatóanyag produkciót az ismertetett morfometriai és/vagy biológiai teszttel (Pieris brassicae, Anagasta kuchniclla) értékeljük. Aktivitás: ALCjo (Pieris) 0,5-2,0 tf% (24 ó. exp.) fermcnlléből. [Entomophaga, Tom. VII. No. 2.101-159 (1962)]. A kapott fermcnllcvet szűréssel és/vagy ccntrifugálással bctöményítjük, tartósítjuk, nedvesítő, cmulgáló, ragasztó, hővédő anyagokkal ismert módon formáljuk, permetező cs/vagy porozószemek, adott esetben porrá alakítjuk. Az ily módon nyerhető készítmények elsősorban Lcpidopterák ellen hatásosak. Hatóanyag: 25-30 billió spóra és kristály/g. Katékony dózis: 0,5-2,0 kg/ha. Eljárhatunk úgy is, hogy a sűrített és előbbiek szerint adalékok fermentlevet porráalakítás nélkül használjuk entomocid hatású készítménynek. A találmányunk szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa A B. thuringiensis var. kurstaki K-Cs 0019 (Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteménye, NCAIM B 001023) törzs tripton-glükóz élesztőkivonat (TGE) 5 napos ferde agar tenyészetéről 0,02 t%-os Tween-80 (oxi-etilezett anhidroszorbit-monodeát) steril oldattal spóra szuszpenziót készítünk. A spóra szuszpenzió 2-2 ml-ével rázott tenyészetet készítünk az alábbi összetételű táptalajon. MgS04.7H20 0,3 g FeS04.7H20 0,02 g ZnS04. zH20 0,02 g CaC03 1,0 g Tripton (DIFCO) 5,0 g Pepton (WITTE) 2,0 g Élesztőkivonat (DIFCO) 2,0 g Glükóz 15,0 g Desztillált víz 1000 ml pH: 7,0 Dozirozás: 50 ml/300 ml E. lombik Stcrilezés: 30 perc, 0,981.105Pa Inkubációs hőmérséklet: 30 'C. Fordulatszám: 300 n/min. Inkubációs idő: 30 óra. A tenyészetben gyakorlatilag spórákat találunk 108—109 db/ml nagyságrendben. A spórás tenyészetből 0,021% Tween 80 steril oldatával hígítási sorozatot készítünk 109 léptékig. 1Ö6 hígítástól 5-5 párhuzamossal bekevert lemezöntéseket készítünk a fenti összetételű táptalaj 2,0 tömeg% agaragarral szilárdított változatán. A lemezeket 30 °C-on inkubáljuk 48 óráig. A kifejlődött telepeket kioltjuk tripton-glükóz-élesztőkivonat ferde agarra, 30 *C-on 48 óráig inkubáljuk, majd a tenyészeteket + 4 ‘C-on tároljuk. A telepekből a kioltással párhuzamosan kikent, hővel fixált tárgylemezkészítményt állítunk elő. Karbolfukszinnal agresszív festést végzünk 4 percig. Vizes mosás, szárítás után homogén immerziós rendszerrel, Hl 100 x MFK 1: 8 optikával, Köhler megvilágítással vizsgálunk. A készítményekben intenzíven festődik a dipiramid delta-endotoxin kristály, jól festődnek a vegetatív sejtek, alig festődnek a kiszabadult spórák. A mikroszkópi kép alapján elvégezzük a szelekciót, az asporogén toxinkristályt nem termelő szubkultúrákat nem tartjuk fenn. A jól spórázó, delta-endotoxin kristály termelő vonalakat rázott szubmerz tenyészetben ellenőrizzük entomotoxikus aktivitásra. 2. példa Az 1. példa szerint rázott szubmerz tenyésztéssel spórás inokulumot állítunk elő a B. thuringiensis var. kurstaki K-Cs 0019 törzs jólspóráző, toxinkristályt termelő szelektált szubkultúrájából. A spórás inokulum 2-2 ml-ével az alábbi összetételű rázott inokulum tenyészetet oltjuk: MgS04.7H20 0,3 g FcS04.7H20 0,02 g ZnS04.7H20 0,02 g 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
