201657. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rovarirtó hatóanyag előállítására Bacillus thuringiensis var. kurstaki fermentálásával
5 HU 201 657 B 6 Bár a batch-rendszcrű szubmerz fermentáció lényegesen előnyösebb mint az SSF eljárás, az egyszeri töltéssel adagolt, mintegy 50 g/1 tápanyag célszerű hasznosulása vitatható. A szacharóz-keményítő szénforrások egyidejű jelenléte elég jelentős mennyiségben diauxiához vezethet. A tenyészet szinkronizálása alig megoldható. A 3 087 865 USA szabadalom (Drake and Smythc, 1963.) olyan B. thuringiensis szubmerz tenyésztési eljárást ismertet, amely 6-12 tömeg% összes bevitt tápanyagot alkalmaz. A B. thuringiensis szaporodási és enzimaktivitásának ismeretében nehezen képzelhető el ennyi szén és nitrogén forrás célszerű felhasználása batch rendszerben. A Szovjetunióban a VASZHNIL dolgozott ki több entomocid készítmény előállítására vonatkozó eljárást eltérő producensekkcl és némileg különböző táptalajokkal (Quinlan R. J., Lisansky S. G.: 1983. Microbial insecticides. Biotechnológy. Vol. 3. Verlag Chemie, Basel. 233-254.). Az említett eljárások nem a találmányunk szerinti cél valósítják meg. A találmányunk szerinti eljárás célja stabilan enlomotoxikus bacillus metabolit előállítása fermentációs úton, amely alkalmas különféle növénykultúrákban a lombrágó kártevők megsemmisítésére. Találmányunk alapja az a felismerés, hogy az entomotoxikus metabolit (delta-endotoxin kristály) szelektív festéssel, fénymikroszkóppal láthatóvá tehető, ismert térfogatban mennyiségileg is értékelhető. Találmányunk alapja továbbá az a felismerés, hogy a morfometriai elemzéssel közvetlenül elvégezhető a dclta-endotoxint termelő B. thuringiensis törzsek szelekciója, nyomon követhető a fermentációs elő és fő inokulunok használhatósága, a főfcrmentáció toxin és spóratermelése. A találmányunk szerinti cél és eljárás az I. M. M. N. G., NCAIM B 001022 számon 1987. november 11-én letétbe helyezett B. thuringiensis var. kurstaki K-CS 0019 láb. sz. törzzsel végzett szubmerz fermentációval valósítható meg. A törzs leírása: Az azonosítást a The Prokaryotes, ed. M. P. Starr et al., Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1981, valamint a Bergcy’s Manual of Determinative Bacteriology, The Williams and Wilcins Co. Baltimore. 1974. VIII. Ed. alapján végeztük cl. Telepmorfológia: TGE agaron 72 órás pctricsészc tenyészetben 5-7 mm átmérőjű, alig kiemelkedő, fehér, sima telepek. HP levesben fehér, zavaros, pelyhes. Felületen ráncos pellicula. Pigmentet nem képez. Gram: + Mikroszkópos morfológia: kerekített végű pálcák, 1,0-1,5 x 2-8 |im. Spóra: centrális, ellipszoid. Parasporális test: +. Flagella: +. Capsula: - Biológiai tulajdonságok: Savképzés D-glükóz: + L-arabinóz: - D-mannit: - Gázképzés D-glükózból: -Indol: - Acetoin: - Kataláz: + Növekedés pH: 5,7 + pH: 6,8 + Növekedés NaCl 2 tömeg%: + NaCl 5 tömeg%: + NaCl 7 lömeg%: - Növekedés 5 'C: - 10 *C: + 30 -C: + 40 °C: + 50 "C: -Na-acctát bontás: + Na-formiát bontás: + Na-oxalát bontás: - Citrát bontás: + Dekarboxiláz Omitin: - Lizin: - Arginin: - Eszkulin bontás: - Nitrátredukció: + V. P. próba: + Glükózbontás: + Keményítőbontás: + Kazeinbontás: + Zsclalinbontás: + Szacharózbontás: + Szalicinbontás: + Mannózbontás: + Hemolizis: alfa, zöldülés Arginin dihidroláz: + Ureabontás: + Entomotoxikus, dipiramidális toxinkristályt termel. Fentiek alapján a törzs B. thuringiensis var. kurstaki. A B. thuringiensis var. kurstaki K-Cs 0019. sz, törzs fenntartása megoldható az ezzel kapcsolatban ismert módszerek bármelyikével, például kiofilczéssel, szilárd táptalajon tenyésztve és 30 naponként átoltva, steril talajon bespóráztatva, vagy más alkalmas módon. Legelőnyösebbnek szelektált törzsek fenntartására a liofilezést találtuk. Találmányunk értelmében az entomotoxikus dipíramidális toxinkristályt termelő törzsek szelekciójánál az alábbiak szerint járunk el. A B. thuringiensis var. kurstaki K-Cs 0019 sz. törzsből rázott szubmerz tenyésztéssel spórás inokulumot állítunk elő 0,1-6,0 tömeg/térf.% szénhidrátot, előnyösen 1,5 tömeg% glükózt, mint egyedüli szénforrást, szerves bioszanyag forrást, előnyösen élesztőkivonalot, szerves nitrogénforrást, előnyösen kazein hidrolizátumot, valamint szervetlen só kát tartalmazó táptalajon. pH: 5,0-8,0, előnyösen 7,0 tenyésztési hőmérséklet: 20-35 ”C, előnyösen: 30 *C, inkubációs idő: 8-72 óra, előnyösen 30 óra. Az ily módon előállított spórás inokulumból ismert módon, például hígítási sorozatból lemczöntésscl, jól elkülönülő telepeket állítunk elő 1,0-2,5 tömeg%, előnyösen 2 tömeg% agar-agarral szilárdított táptalajon. Ez a táptalaj lehet a fentebbi összetétellel ismertetett, vagy más változat is, amellyel különböző táptalaj komponensek és paraméterek hatását kívánjuk vizsgálni az entomotoxikus komponensekre. A szilárd táptalaj tenyészeteket 20-30 'C-on, előnyösen 30 "C-on inkubáljuk 16-72 óráig, előnyösen 48 óráig. Eljárhatunk úgy is, hogy a spórás inokulumot ismert módon mutagénckkel kezeljük. A kifejlődött telepeket a fentebb ismertetett összc-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
