201608. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok meghatározására , az ehhez szükséges analitikai készlet és eljárás a specifikus antitest előállítására
15 HU 201608 B 16 antibiotikum és vankomicin oldatokat alkalmazva nem volt megfigyelhető kötődés. 6. példa Teikoplanint tartalmazó szérumminták vizsgálata Standard görbét veszünk fel skaláris teikoplanin-hígítésokkal a 0,001-1 Mg/ml tartományban, oldószerként pH 7,3 foszfátpufferes sóoldatot alkalmazva (0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid), amely 3 súly/térf.% BSA-t, 0,05 térf./térf.X Tween 20- -at és 20% humán szérumot tartalmaz. A mintákat a szérum-pufferrel ötszörösre hígítjuk és 0,1 ml-nyi ilyen oldatokat a 2. példa szerinti eljárással előállított, BSA-epszilon-ACA-D-Ala-D-Ala-val bevont flexibilis lemezek üregeibe mérünk be, három párhuzamos kísérletben. Az aspecifikus kötődés kiértékelésére a magasabb koncentrációjú oldatot hozzáadjuk a .vak" üregekhez is (ezek az olyan mélyedések, amelyeket nem vontunk be specifikus D-Ala-D-Ala kötőanyaggal). A mikrolemezeket ezután 2 órán át szobahőmérsékleten nedves, fedett kamrában inkubáljuk és nyolcszor mossuk, oly módon, hogy kiürítjük, majd pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal (0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid, 0,05 térf./térf.X Tween 20) töltjük meg a lyukakat és rázogatással szárítjuk meg a lemezt. Ezután a 3. és 4. példa szerint előállított, teikoplanin elleni tisztított nyúl antiszérumot foszfátpufferes sóoldattal ötvenszeresére hígítunk (0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid, pH 7,3, 3X tömeg/térf. BSA, 0,05 térf./térf.X Tween 20 és 20X humán szérum). Ebből az oldatból 100-100 (Hitért adunk mindegyik üregbe és 1 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk végbemenni a reakciót. pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal (0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid, 0,05 térf./térf.X Tween 20) való nyolcszori mosás után a lemezeket az előbbiekben leirt módon rázogatéssal megszáritjuk. Mindegyik lyukba bemérünk 100 (iliter 1-500-szoros hígítást - 20X humán szérumot tartalmazó foszfátpufferes sóoldattal elkészítve - egy nyúl-IgG-ekkel szembeni, torma-peroxidázzal konjugált kecske-antiszérumból és a lemezeket 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután az üregeket ismét mossuk pH 7,3 foszfátpufferes sóoldattal (0,05 M nátrium-foszfát, 0,15 M nátrium-klorid, 0,05 térf./térf.X Tween 20), az előbbiek szerint rázogatással szárítjuk, majd mindegyik lyukba bemérünk 200 (iliter kromogén peroxidáz szubsztrát oldatot) 1 mg/ml o-fenilén-diamin, 5 mM hidrogénperoxid pH 5 0,1 M nátrium-citrát pufferben (és 30 percen át szobahőmérsékleten hagyjuk kifejlődni a színt. A szinfejlesztó reakciót ekkor 50 (íliter/lyuk 4,5 M kénsav hozzáadásával leállítjuk és 15 perc elteltével 492 nm-en mérjük az abszorpciót Titertek Multiscan fotométer) Flow Lab. Inc.) alkalmazásával. A kötési görbéket úgy kapjuk meg, hogy féllogaritmikus papíron felvesszük az abszorpció értékeket a teikoplanin koncentráció függvényében. A 0,01-1 Mg/ml tartományban dózis-válasz görbét kapunk a teikoplaninnal és a minta koncentrációját a standard görbe alapján, interpolálással határozzuk meg. Ismert mennyiségű teikoplanint tartalmazó oldatok ismételt elemzése, az előbbi eljárás alkalmazásával, arra mutat, hogy ez a módszer kielégíti az érzékenység, szabatosság és pontosság iránti analitikai követelményeket. A példa szerinti esetben a következő eredményeket kapjuk (amelyek általános vonatkozásban a találmány szerinti eljárás bármely alkalmazására ugyancsak érvényesnek tekinthetők: Alkalmazási tartomány (ismételt kísérletek alapján): 10 ng/ml-töl. Kitüntetett alkalmazási tartomány: 10 ng/ml-1 mg/1 teikoplanin. Pontosság: a kísérleten belül: CV (variációs koeficiens)= =10,5 a kísérletek között: CV (variációs koeficiens)=13,2 Az előbbi módszert ismételten alkalmazva avoparcin, risztocetin, aktaplanin, A 35 512 B antibiotikum, A 41 030 antibiotikum, A 47 984 antibiotikum és vankomicin oldatok meghatározására nem figyelhető meg kötődés. Lényegében a 6. példában leírt eljárást alkalmazva genny, hörgő eredetű köpet és égett bőr minták meghatározására teikoplaninnel kezelt betegek esetében az antibiotikum koncentrációját a minta homogenizálása után állapítjuk meg, amihez a 6. példában leírt 20% szérumot tartalmazó pufferoldatot alkalmazzuk. Az eljárás ilyen minták elemzésekor is megőrizte az előbbiekben ismertetett érzékenységi, pontossági és szabatossági szintet. A teikoplanin előállítása A teikoplanint úgy állítjuk elő, hogy az Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31 121 törzset a 4 239 751 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon tenyésztjük és az anyagot Sephadex oszlopkromatográfiával vagy más, ezzel egyenértékű tisztítási módszerrel tisztítjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
