201578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bottromycin A2 előállítására
5 HU 201578 B Mikromorfológia: különbőzó tépagar közegen (ISP-Mz, ISP-Ms, ISP-M4, ISP-Ms) laza, 2-3 kanyarulatú, Retinaculum-apertum-tipusú (spiral) spóratartók képződnek. A spórák elektronmikroszkópos megfigyelések szerint sima felületüek és nem ornamentáltak. A szubsztrétmicélium indikátor karaktere nem észlehetö. A 85-211 jelű törzs viselkedése a különböző tápközegeken: Szintetikus-agar: Légmicélium nincs; szubsztrátmicóliura nagyon gyengén fejlett; oldódó pigment nincs. Keményitő-kazein-agar: Fejlett, porszerű, hamuszürke légmicélium; fejlett, gyűrt, sötétbarna szubsztrétmicélium; világosbarna diffundáló pigment. Czapek-agar: Fejlett, gyapjas, világosbarna légmicélium; sötétbarna, gyűrt szubsztrátmicélium; világosbarna oldódó pigment. Zabpehely-agar: Fejlett hamuszürke légmicélium, fejlett, világosbarna, gyűrt szubsztrétmicélium; világosbarna oldódó pigment. Maláta-agar: Közepesen fejlett, foltokban megjelenő, szennyesszürke, gyapjas légmicélium; fejlett, gyűrt, barna szubsztrátmicélium; sötétedő barna oldódó pigment. Nutrient-agar: Légmicélium nincs; a szubsztrátmicélium színtelen és gyengén fejlett; oldódó pigment nincs. Keményító-élesztókivonat-agar: Fejlett, porszerű, vörösesszürke légmicélium; rendkívül fejlett, gyűrt, sárgásbarna szubsztrétmicélium; sötétbarna oldódó pigment. Burgonya-agar: Közepesen fejlett, fehéresszürke légmicélium; fejlett, gyűrt, szennyessórga szubsztrétmicélium; világosbarna oldódó pigment. Szója-agar: Légmicélium nyomokban, fejlett barna szubsztrétmicélium; világosbarna oldódó pigment. Az 1. táblázatban összehasonlítjuk a 85- -211 jelű Streptomyces törzs rendszertani tulajdonságait a korábban leirt, bottromycin A2-t termelő és faji szinten azonosított, illetve nem meghatározott Streptomyces törzsekkel, továbbá a Streptomyces collinus típus törzsével (ISP 5129). Látható a 85-211 jelű törzs éles különállása a Streptomyces canadensis Ma-959 és a Streptomyces sp. 3668-L2 törzsektől, továbbá a teljes azonossága a Streptomyces collinus tipustőrzsével. Hasonlóságot észleltünk a Streptomyces bottropensis irányába, de a két fajt a melanoid pigment termelés tirozin agaron, a szubsztrátmicélium pigmentáltséga, végül a raffinóz értékesítés lényegesen elkülöníti egymástól. A fenti rendszertani vizsgálatok adatai szerint a törzs a Streptomyces collinus faj tipikus alakja. A 85-211 jelű Streptomyces collinus törzset 1988. november 30-án letétbe helyeztük a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében (Budapest), ahol az NCAIM B(P) 001073 letéti számot kapta. A fentiek alapján a találmány eljárás az (I) képletű bottromycin A2 antibiotikum előállítására süllyesztett, levegőztetett körülmények között végzett fermentációval, amely abban áll, hogy a Streptomyces collinus faj NCAIM B(P) 001073 letétbe helyezett törzsét vagy annak valamely - bottromycin A2-t termelő - mutánsát vagy variánsát szerves nitrogén- és szénforróst, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon 24 és 32 °C közötti hőmérsékleten tenyésztjük, majd a termelt antibiotikumot a tenyészetből elkülönítjük. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott Streptomyces collinus törzs tenyésztésére a Streptomycesek tenyésztésére általánosan ismert módszereket használhatjuk. A törzset célszerűen élesztókivonat-keményitó agaron tartjuk fenn. Ezen a táptalajon a törzs megőrzi termelőképességét. Streptomyces collinus törzs süllyesztett kultúrában történő tenyésztésénél szénforrásként glükóz, keményítő és növényi olajok, nitrogénforrásként szójaliszt, kukoricalekvár, illetve kazein, szervetlen sóként kálium-nitrát, nátrium-klorid, dikálium-hidrogénfoszfót, vas-szulfát, magnézium-szulfát és kalcium-karbonát alkalmazható előnyösen. A törzs süllyesztett, levegőztetett tenyészetben, 24 °C és 32 °C közötti hőmérsékleten jól növekszik, az antibiotikum bioszintézis szempontjából előnyös á tenyésztést 26 °C és 30 °C között végezni. A bottromycin A2 antibiotikum izolálásakor célszerű a mikroorganizmus sejtjeit 3-as pH-n szűréssel elkülöníteni. A fermentlé pH = 3-on történő szűrésénél a bottromycin A2 nagyrészt a szűrletben található, és a szűrletből extrakciós módszerrel nyerhető ki. Az antibiotikum extrakcióját pH = 9-en, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen etil-acetáttal végezhetjük. A mikroorganizmus sejtjeihez kötődő antibiotikumot a szűréskor kapott nedves micéliumról előnyösen vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel, pl. alkoholokkal (metilalkohol, etilalkohol, butanol) illetve acetonnal oldhatjuk le. A kapott kivonatot csökkentett nyomáson bepárolva vizes maradékhoz jutunk, melyből pH = 9-en vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen etil-acetáttal vonhatjuk ki az antibiotikumot. Az egyesített etil-acetátos extraktumok vákuumban történő bepárlásával kapjuk a nyersterméket, amelynek tisztítására előnyösen oszlopkromatogrófiás módszert alkalmazhatunk. A tisztítás célszerűen szilikagél oszlopon végzett kromatogrófiával történhet. A kromatografáláskor eluensként előnyösen n-hep-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
