201577. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporin antibiotikumok előállítására
9 HU 201577 B 10 glükóz 40 g kazein-pepton 5 g nátrium-nitrát 3 g kálium-dihidrogén-foszfát 2 g kálium-klorid 0,5 g magnézium-szulfát-víz (1 : 7) 0,5 g vas( II l-szulfát-víz (1 : 7) 0,01 g 1000 ml csapvizben. A táptalaj pH-jét sterilezés előtt 5,2 értékre állitjuki és a sterilezést 121 °C-on, 25 percig végezzük. A tenyészetet 25 °C-on, sikrázó gépen (340 fordulat/perc; 3,5 cm kitérés) 3 napig rázatjuk, majd a kapott inokulum tenyészet 5-5 ml-ével 15 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 100-100 ml FCi jelű steril táptalajt oltunk be. FCi jelű táptalaj összetétele: glükóz 80 g tripkazin 40 g karbamid 2 g ammonium-szulfát 12 g nátrium-nitrát 3 g kálium-dihidrogén-foszfát 2 g kálium-klorid 0,5 g magnézium-szulfát-viz (1 : 7) 0,5 g vas( II )-szulfét-viz (1 : 7) 0,01 g 1000 ml csapvizben. tripkazin = tripszinnel emésztett kazein kereskedelmi neve (gyártó: HUMAN Oltóanyag-termeló és Kutató Intézet, Gödöllő) A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 5,2 értékre állitjuk, és a sterilezést 121 °C-on, 25 percig végezzük. A lombikokat 25 °C-on, sikrázó gépen (340 fordulat/perc, 3,5 cm kitérés) rázatjuk. A fermentlé antibiotikum tartalmának változását agar-diffúziós, mikrobiológiai módszerrel követjük a fermentáció során. Az agar-diffúziós mikrobiológiai értékmérés a ciklosporin gombaellenes hatásán alapul. Tesztorganizmusként Aspergillus niger-t használunk. A bioszintetizálódó ciklosporin-antibiotikum-komplex aktivitását ciklosporin A standarddal szemben mérjük. 2- -8 /ug/ml ciklosporin A vizes alkoholos oldata 16-25 mm-es gátlásgyűrűt ad 7-es pH-jú élesztőkivonat-glükóz-agar mérótáptalajon. A fermentációt 168 óráig folytatjuk, majd a fermentléből kinyerjük a ciklosporin antibiotikum-komplex komponenseit. 1 liter fermentléből, amely a fermentáció leállásakor mikrobiológiai értékméréssel mérve 400 /ug/ml ciklosporin-komplexet nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel mérve 334 ug/ml ciklosporin A-t tartalmazott, az alábbi módon izoláljuk a ciklosporin antibiotikum komponenseket. A fermentléből szűréssel elkülönítjük a sejteket, melyekről kétszer 200 ml metanollal leoldjuk az antibiotikumokat. A kapott metanolos vizes oldatból a metanolt csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és a hatóanyagot a vizes sűrítményből kétszer 50 ml n-butil-acetáttal kivonjuk. A fermentlé szűrletéból a ciklosporin-komplexet 200 ml n-butil-acetáttal extraháljuk. Az n-butilacetátos extraktumokat egyesitjük, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson, 40 °C-on bepároljuk. A kapott 3,7 g tömegű nyersterméket 10 ml metanolban feloldjuk és metanollal készített Sephadex LH-20 gélágyon (40 cm magas, 2,5 cm átmérőjű) metanolos elúcióval elválasztjuk a lipofil szennyezéseket. A ciklosporin-komplexet tartalmazó frakciókat csökkentett nyomáson 40 °C-on bepároljuk. Az igy nyert ciklosporin-komplex (1,05 g) komponenseinek kromatográfiás elválasztását 20 g szilikagélböl (Kieselgel 40, Reanal, Budapest) készített oszlopon fokozatosan növekvő metanoltartalmú kloroform-metanol elegyekkel végezzük. Az elúciót 100 ml kloroformmal kezdjük, majd 100 ml-ként 0,5%-kal növekvő metanoltartalmú kloroform-metanol elegyekkel folytatjuk. A kromatográfiás frakciók ciklosporin tartalmát vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel vizsgáljuk [lemez: Kieselgel 60 F254, DC Alufólia (Merck), kifejlesztő elegy: etilacetát-izopropanol 95 : 5, előhívás: jód gőz], A ciklosporin A 2,0%, a ciklosporin B 2,5%, a ciklosporin C 3,0% metanoltartalmú kloroformmal oldódódik le az oszlopról. Az egyes ciklosporin-komponenseket tisztán tartalmazó kromatográfiás frakciókat vákuumban bepároljuk. így 225 mg ciklosporin A-hoz [op.: 137-140 °C, [oC)d-189° (metanol)); 25 mg ciklosporin B-hez (op.: 149-151 °C) és 22 mg ciklosporin C-hez (op.: 150-152 °C) jutunk. 2. példa Az 1. példában leírt módon készített inokulum rázott tenyészet 200 ml-ével oltunk 10 literes laboratóriumi fermentorban 45 percig, 121 °C-on sterilezett, 5 liter térfogatú IC jelű inokulum táptalajt. A beoltott tenyészetet 25 °C-on 750/perc fordulatszémmal kevertetjük és óránként 300 liter levegővel áramoltatjuk át. A fermentációt 72 óráig folytatjuk, majd a kapott inokulum tenyészet 500 ml-ével 10 literes laboratóriumi fermentorban 45 percig, 121 °C-on sterilezett, 5 liter FC2 jelű táptalajt oltunk be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
