201577. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporin antibiotikumok előállítására
1211 HU 201577 B FCz jelű táptalaj összetétele: glükóz 80 g tripkazin 40 g karbamid 2 g ammónium-szulfát 12 g nátrium-nitrát 3 g kálium-dihidrogén-foszfát 2 g kálium-klorid 0,5 g magnéziuni-szulfát-viz (1 : 7) 0,5 g réz(II)-szulfát-viz (1 : 7) 0,01 g mangánt II)-szulfát-víz (1 : 1) 0,01 g vas(II)-szulfát-viz (1 : 7) 0,01 g 1000 ml csapvizben. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 5,2 értékre állítjuk. A beoltott tenyészetet 25 °C-on, 750/- 20 perc fordulatszámmal kevertetjük és óránként 300 liter levegővel áramoltatjuk át. A fermentációt a fenti módon 144 óráig folytatjuk és a maximális ciklosporin koncentráció elérésekor fejezzük be. 25 4,8 liter fermentléból, mely a fermentáció végén mikrobiológiai értékméréssel mérve 500 ug/ml ciklosporin-komplexet, nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel mérve 445 Mg/ml ciklosporin A-t tartalmazott, az 30 alábbi módon izoláljuk a ciklosporin A-t. A fermentléból centrifugálással elkülönítjük a sejteket, majd a kiülepedett sejtekről kétszer 1 liter metanollal leoldjuk a ciklosporin-komplexet. A kapott metanolos-vizes 35 oldatból csökkentett nyomáson eltávolítjuk a metanolt és a hatóanyagot a vizes sűrítményből 2 x 250 ml n-butil-acetáttal kivonjuk. A fermentlé szűrletéből a ciklosporin-komplexet 2 x 500 ml n-butil-acetáttal extraháljuk. 40 Az n-butil-acetátos extraktumokat egyesitjük, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson, 40 °C-on bepároljuk. Az így kapott 19,2 g nyerstermék előtisztítását oszlopkromatográfiával végezzük 100 g 45 Kieselgel 60 adszorbenst (szemcseméret: 0,063-0,2 mm) tartalmazó oszlopon kloroform-metanol-aceton (92 : 4 : 4) eluáló elegyet alkalmazva. A ciklosporin-komplexet tartalmazó frakciókat (vékonyréteg-kromatográfiás 50 analízis : lemez : Kieselgel 60 Fzm, DC alufólia (Merck); kifejlesztő elegy : hexán-aceton 2 : 1; előhívás : klór/tolidin reagens) szárazra pároljuk. A kapott bepárlási maradékból (5,28 g) oszlopkromatográfiával nyerjük ki a 55 ciklosporin A-t. Az oszlop készítéséhez 115 g Kieselgel 60 adszorbenst (szemcseméret: 0,063-0,2 mm) használunk. Az elúciót növekvő acetontartalmú hexán-aceton elegyekkel végezzük. A ciklosporin A 23% acetontartalmú go n-hexánnal oldódik le az oszlopról. A ciklosporin A-t tartalmazó frakciók bepárlásával 1,46 g ciklosporin A-t kapunk, amelynek fizikai jellemzői azonosak az 1. példában megadottakkal. 65 3. példa A Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 jelű törzs (NCAIM(P) F 001005] malátakivonat-élesztőkivonat tartalmú ferdeagaron növesztett 5-7 napos tenyészetéről 5 ml 0,9%-os nátrium-klorid oldattal spóraszuszpenziót készítünk. Ezzel 3 literes Erlenmeyer lombikban sterilezett 800 ml, az 1. példában megadott összetételű IC jelű inokulum táptalajt oltunk. A lombikot 25 ‘C-on, sikrázó gépen (340 fordulat/perc; 3,5 cm kitérés) 2,5 napig rázatjuk, majd az igy kapott inokulum tenyészettel 10 1-es laboratóriumi fermentorban 45 percig, 121 °C-on sterilezett, 5 liter FC3 jelű táptalajt oltunk be. FC3 jelű táptalaj összetétele: szorbóz 60 g tripkazin 40 g karbamid 2 g ammónium-szulfát 12 g nátrium-nitrát 3 g kálium-dihidrogén-foszfát 2 g kálium-klorid 0,5 g magnézium-szulfát-víz (1 : 7) 0,5 g mangánt II )-szulfát-viz (1 : 7) 0,01 g vas(II)-szulfát-viz (1 : 7) 0,01 g 1000 ml csapvizben. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 5,2 értékre állítjuk. Az 5 liter tenyészetet 25 °C-on termosztáljuk és 1000/perc fordulatszámmal kevertetjük, miközben óránként 300 liter levegővel áramoltatjuk át. A fermentációt 144 óráig folytatjuk, ekkor a fermentlé mikrobiológiai értékméréssel mérve 600 Mg/ml ciklosporin-komplexet, nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel mérve 505 ug/nil ciklosporin A-t tartalmaz. Az izolálást 1 liter fermentléból a 2. példában megadott módon végezve 310 mg ciklosporin A-t kapunk, amelynek fizikai jellemzői azonosak az 1. példában megadottakkal. 4. példa A Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 jelű törzs (NCAIMIP) F 001005] malátakivonat-élesztókivonat tartalmú ferdeagaron növesztett 5-7 napos tenyészetéről 5 ml 0,9% nátriumklorid oldattal spóraszuszpenziót készítünk, és ezzel oltunk 3 literes Erlenmeyer lombikban sterilezett 500 ml, az 1. példában megadott IC jelű inokulum táptalajt. A lombikot 25 °C-on malomszita rázógépen (340 fordulat/perc; 3,5 cm kitérés) 3 napig rázatjuk, majd a kapott inokulum rázott tenyészettel 10 literes laboratóriumi fermentorban 45 percig 121 °C-on sterilezett, 5 liter FC4 jelű táptalajt oltunk be. 8
