201566. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a humán növekedési hormon elválasztását serkentő faktor új analógjainak és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítményeknek és állattenyésztésben alkalmazható készítményeknek az előállítására
5 HU 201566 B 6 A találmány szerint előállított vegyületek hatására bekövetkező GH-szint változását in vivo körülmények között a következőképpen vizsgáltuk: 250-300 g testtömegű ivarérett hím Wis- 5 tar R Amsterdam patkányokat 60 mg/kg pentobarbitallal altattunk (a pentobarbitalt intraperitoneálisan adtuk be). A peptideket 0,9 tömegX-os vizes nátrium-klorid oldatban oldottuk, és 20 perccel az altatás után intra- 10 vénás injekció formájában adtuk be az állatoknak. Az állatok juguláris vénájából a hatóanyag beadása előtt, majd a hatóanyag beadását követő 5., 15. és 30. percben vérmintát vettünk, és meghatároztuk a vér GH kon- 15 centrációját. Példaképpen a Nle^.Gaba30- -hGRF(l-29)-NH2-acetátsóval végzett vizsgálat eredményeit közöljük. Standardként hGRF(l-29)-NH2-t használtunk, a vizsgálandó mintát és a standardot 2 /ug/testtömeg kg 20 mennyiségben intravénásán adtuk be. A GH elválasztás mindkét anyag hatására fokozódott, azonban a találmány szerint előállított vegyülettel kezelt állatok vérének GH-szintje a standarddal kezelt állatokéhoz viszonyítva 25 5 perc után 164X, 10 perc után 155%, 30 perc után pedig 204% volt. A találmány szerint előállított új vegyületek előnyeit a következőkben foglalhatjuk össze: 30- A natív hormonénál lényegesen nagyobb aktivitást mutatnak.- A Gaba az élő szervezetben (pl. idegrendszerben) előforduló anyag, így nem szervezet-idegen, metabolizmusa tisztázott. 35- A Gaba térkitöltése miatt a szilárd fázisú peptidszintézisben kiváló .spacer", igy a peptidet hordozó polimerhez első aminosavként kapcsolva jó szintézis-hatásfokot biztosít. 40 1. mosás CH2CI2 2. hasítás 33% TFA/CH2C12 3. hasítás 33% TFA/CH2CI2 4. mosás CH2CI2 5. mosás etanol 6. mosás CHCb 7. semlegesítés 10% EtaN/CHCla 8. mosás CHCb 9. mosás CH2CI2 10. Boc-aminosav hozzáadás 11. kapcsolás DIC 12. mosás CH2CI2 13. mosás etanol- A peptid 27. helyzetében a Met-nak Nle-nal való helyettesítése a szintézis szempontjából kémiailag előnyös. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban részletesebben ismertetjük. A példákban az .ekvivalens" megjelölésen mólekvivalenst értünk. 1. példa Nle^jGaba^-hGRFl l-30)-NH2-acetátsó előállítása A peptidet Beckman 990B peptidszintetizátort használva benzhidrilamin-gyantán (kapacitás: 0,65 milliekvivalens/g) állítjuk elő. A Boc-Gaba-OH védett aminosavat a gyanta kapacitására számítva három ekvivalens feleslegben használjuk, a védett arainosavval ekvivalens mennyiségű DIC kondenzálószert és ugyancsak ekvivalens mennyiségű HOBt katalizátort használunk. A Boc-Gaba-OH felkapcsolásának reakcióideje 12 óra. Ezután a gyantához kapcsolás teljességének ellenőrzésére a gyanta - védett aminosav vegyületet ninhidrin reakcióval vizsgáljuk. A Boc-Gaba-OH gyantához kapcsolása általában első kapcsolásra tökéletes; ha esetleg a ninhidrin reakció pozitív eredményt adna (ami arra utal, hogy a benzhidrilamin-gyanta aminocsoportjai nincsenek teljesen szubsztituálva), a gyantához kapcsolást szimmetrikus anhidrid módszerrel tehetjük teljessé. (Tömegnövekedés alapján a gyanta kapacitása 75-80%-a a gyártó cég által megadott kapacitásnak.) A Boc-Gaba-BHA gyantát a szokásos módon hasítjuk és semlegesítjük, ezután a peptidszintézist lépésről lépésre elvégezzük, a következő vázlat szerint: háromszor 2 perc egyszer 2 perc egyszer 25 perc háromszor 2 perc háromszor 2 perc háromszor 2 perc kétszer 3 perc kétszer 2 perc háromszor 2 perc egyszer 120-300 perc kétszer 2 perc A Boc védőcsoport lehasításakor a másodreakciók megakadályozására 0,5% indol és 0,2% tioanizol vagy 1% anizol és 0,5% dietil-szulfid elegyét alkalmazzuk. A szintézis sorén 1 mmol Boc-Gaba-BHA gyantára a szekvenciának megfelelő sorrendben 3 mmol Boc-aminosavat, 3 mmol DIC kapcsolószert és 3 mmol HOBt katalizátort használunk diklór-metános oldatban. A Boc-Arg(Tos)0H kapcsolásakor dimetil-formamid és diklór-metán 1:1 térfogatarányú elegyét használjuk. Az összes védett aminosav kap- 60 csolását karbodiimid módszerrel végezzük, kivéve a Boc-Gln, illetve a Boc-Asn esetében, amikor a megfelelő védett aminosav p-nitro-fenil-észterét használjuk háromszoros feleslegben, ekvivalens HOBt katalizátor jelenlété- 65 ben. Ebben az esetben a reakciót dimetil-5
