201566. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a humán növekedési hormon elválasztását serkentő faktor új analógjainak és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítményeknek és állattenyésztésben alkalmazható készítményeknek az előállítására
7 HU 201566 B 8 -formamid és diklór-metán 1:1 térfogatarányú elegyében 12-14 órán ét végezzük. A védett aminosavak oldalláncait Tyr, Ser és Thr esetében benzilcsoporttal, Lys esetében 2-klór-benzil-oxi-karbonil-csoporttal (2C1-Z), Arg 5 esetében tozilcsoporttal (Tos), a Glu és Asp karboxilcsoportjait ciklohexilcsoportokkal (Chx) védjük. Az oldalláncok védőcsoportjait és a pepiidet a gyantáról cseppfolyós HF segítségével 10 tévolítjuk el úgy, hogy a peptid - gyanta vegyületet 0,25 mmol peptid-BHA gyanta esetén 2,5 'ml 10 tómegX p-krezolt tartalmazó anizol és 100 mg ditio-treitol jelenlétében körülbelül 20-25 ml HF-ban 0 °C-on 1 órán 15 ét tartjuk. A HF-ot csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot abszolút dietil-éterrel kezeljük, és a szilárd maradékról a pepiidet 15 tömegX-os ecetsavban oldjuk le. A hidrogénfluorid-sóként jelenlévő peptidet 15 tö- 20 megX-os ecetsavban Sephadex G-50 oszlopon gélszűréssel tisztítjuk. Ezt követően a peptidet MPLC módszerrel Cis reverz fázisú szilikagél oszlopon (Syncroprep RP-4, 3u) 0,25 mólos trietil-amin-foszfát (TEAP, pH: 2,55) és 25 40 térfogatX TEAP - 60 térfogatX acetonitrilböl készített gradiens oldatok segítségével tisztítjuk. A frakciókat, amelyek a peptidet foszfátsóként tartalmazzák TLC és HPLC vizsgálatokkal azonosítjuk, a kívánt terméket 30 tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk. A maradékot sómentesités és további tisztítás céljából ismételten MPLC oszlopra visszük, és 10 tömegX-os ecetsav oldatból, valamint 30 35 térfogatX izopropanolt tartalmazó 10 tömegX-os ecetsav oldatból gradiens elúciót végzünk. A frakciók - amelyek a peptidet acetátsóként tartalmazzák - tisztaságát és terméktartalmát a fentiek szerint határozzuk 40 meg. Végül a peptid-acetátsót fagyasztva szárítással szilárd anyag formájában különítjük el. Az így előállított Nle^Gaba30- -hGRF(l-30)-NH2 alkalmas in vitro vizsgálatokra sejtkultúrában és szuperfúzióban, va- 45 lamint in vivo vizsgálatokra. A termék fizikai jellemzői a következők: TLC: Rf=0,54 (adszorbens: DC Alufolien Kieselgel 60/katalógusszám: 5553/, futtatószer: 15:10:3:12 térfogatarányú n-butanol: 50 :piridin: ecetsav: víz elegy); 0,40 (futtatószer: 4:1:2 térfogatarányú n-butanol:ecetsav: :viz elegy). HPLC: Adszorbensként Vydac 218 TP 546 oszlopot, eluálószerként 30 térfogatX aceto- 55 nitrilt és 70 térfogatX 0,25 mólos vizes trietil-ammónium-foszfát oldatot (pH=2,25) tartalmazó elegyet használtunk. A meghatározást UV elnyelés alapján 215 nm-en, 0,1 AuFS érzékenység mellett végeztük. Az ISCO (Model 60 2350) HPLC pumpák vezérlése IBM-XT számítógéppel ISCO ChemResearch program szerint történt. Izokratikus elúciót végeztünk, a terméket a retenciós idő és az áttörési idő hányadosával (k’) jellemeztük. k’=4,37. 2. példa Nie*,Gäbet®-h GRF(1- 30)-OH-aceté tsó előállítása A peptidet az 1. példában leírtak szerint, azonban Merrifield gyantán (klór-metil gyanta) állítjuk elő. A gyantát (kapacitása: 0. 5-0,9 milliekvivalens/g) háromszoros feleslegben vett Boc-Gaba-céziumsóval, dimetil-formamidban 50 °C-on 20 órán át reagáltatjuk. A reakció eredményeként 0,4-0,6 mmol Gaba/g szubsztituált gyantát kapunk. A peptidszintézist az 1. példában leírtak szerint végezzük, és a kapott peptidet az 1. példában megadott módon tisztítjuk. A kapott termék TLC és HPLC vizsgálatok szerint egységes. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az (I) általános képletű peptidek savaddiciós sóinak előállítására H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Sei—Ala-Arg-Lys- (I) -Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-Gaba-Y - a képletben Y hidroxilcsoportot vagy aminocsoportot jelent -, azzal jellemezve, hogy a megfelelően védett aminosavakat a peptidkémiában ismert módszerekkel a megfelelő sorrendben összekapcsoljuk, a védőcsoportokat lehasítjuk, és kívánt esetben a savaddiciós sóként kapott peptidet egy másik savaddiciós sóvá alakítjuk. 2. Eljárás a növekedési hormon kibocsátását elősegítő gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű vegyületeknek - a képletben Y jelentése az 1. igénypontban megadott - az 1. igénypont szerint előállított gyógyászatilag alkalmazható savaddiciós sóit a szokásos gyógyszerészeti segédanyagokkal összekeverjük, és gyógyszerkészítményekké alakítjuk. 3. Eljárás az állattenyésztésben felhasználható kompozíciók előállítására, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű vegyületeknek - a képletben Y jelentése az 1. igénypontban megadott - az 1. igénypont szerint előállított, az állattenyésztésben alkalmazható savaddiciós sóit állattenyésztési célokra alkalmas segédanyagokkal összekeverjük, és állattenyésztésben felhasználható kompozíciókká alakítjuk. Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető R-4967 - KJK 91.3520.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató
