201566. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a humán növekedési hormon elválasztását serkentő faktor új analógjainak és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítményeknek és állattenyésztésben alkalmazható készítményeknek az előállítására
1 HU 201566 B 2 A találmány tárgya eljárás a humán növekedési hormon elválasztását serkentő faktor (hGRF) új analógjainak előállítására. A találmány továbbá az új vegyületeket hatóanyagként tartalmazó humán- és állatgyógyászati készítmények, valamint az állattenyésztésben alkalmazható kompozíciók előállítására vonatkozik. A növekedési hormon elválasztását serkentő hormonok - más néven növekedési hormon releasing faktorok (Growth Hormone Releasing Factor), a továbbiakban: GRF - és analógjaik a humán- és állatgyógyászatban és az állattenyésztésben egyaránt fontos szerepet játszanak. A humán gyógyászatban a növekedési hormon hiányával vagy csökkent elválasztásával összefüggő rendellenességek kezelésére, az állatgyógyászatban és állattenyésztésben pedig elsősorban a növekedés serkentésére, a táplálék hasznosulásának fokozására, a hús/zsír arány javítására és a tejtermelés növelésére alkalmazhatók. A natív humán GRF (a továbbiakban: hGRF) izolálásét (Nature 300, 276 /1982/; Science 218, 585 /1982/) követően hamarosan megkezdődtek a kémiai szerkezet és a biológiai hatás közötti összefüggéseket tisztázó kutatások. Azt találták, hogy a hGRF - ami egy 44 tagú peptid - aminosavszekvenciája nagymértékben hasonló több emlős (így sertés, marha, juh) szervezetéből elkülönített GRF aminosavszekvenciájához. A molekulák aktív centrumának általában a 3-21. aminosavakat tartalmazó rész mutatkozott. A rövidebb peptidláncok biológiai aktivitása általában kisebb a natív hormonénál, de a kísérletek azt igazolták, hogy még a hGRF(l-29)-NH2 (vagyis a natív, humán eredetű, az N-terminálistól számított 1-29. aminosavakat tartalmazó peptid-amid) is kedvező aktivitást mutat a természetes hGRF(l-44)-NH2-hoz viszonyítva (Nature 300, 276 /1982/; J. Med. Chem. 30, 219 /1987/; Peptides 481. oldal (szerk.: D. Theodoropoulos, kiadó: Walter de Gruyter; Berlin, New York, 1988/; Proceedings of the Ninth Am. Peptide Symposium /kiadó: Pierce Chem. Co., Rockford, Illinois, 1985/ 707. oldal; Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 854 /1984/). A hGRF-(l-29)-NH2 analógjaival végzett vizsgálatok során bebizonyosodott, hogy az N-terminális rész meghatározóbb a biológiai aktivitás szempontjából, mint a C-terminális rész, továbbá a peptidek aktivitása általában kisebb a peptid-amidokénál (J. Med. Chem. 28, 181 /1985/). Megállapították azt is, hogy a nativ hormonnál kisebb tagszámú peptidek biológiai aktivitása kedvezően befolyásolható úgy, hogy a peptidlánc egyes aminosavjait más aminosavakkal helyettesítik (J. Med. Chem. 28, 181 /1985/). Az előbbi közleményekből az is ismeretes, hogy a nativ GRF(l-29)-NHz aminosavszekvenciája embernél és sertésnél megegyezik. Szarvasmarhánál például ezekétől eltér a 28. helyen (szerin helyett aszparagint tartalmaz), azonban kimutatták, hogy a hGRF(l-44I-NH2 és hGRF(l-29)-NH2 adagolásával a szerkezeti eltérés ellenére kedvezően befo- 5 lyásolható a szarvasmarhák tejtermelése mind mennyiségi, mind minőségi szempontból (J. Dairy Science 70, 2511 /1987/ és 71, 92 /1988/). A találmány célja olyan hGRF-analógok 10 előállítása, amelyek hatásukat tekintve legalább elérik vagy felülmúlják a natív hormont, illetve annak 1-29. aminosavból álló szekvenciáját. A találmány alapja az a felismerés, hogy 15 a natív hGRF hatásét jelentősen felülmúló aktivitásúak azok a harminc aminosavból felépülő analógok, amelyek aminosavösszetétele mindössze két helyen tér el a natív hGRF(l-30J-OH, illetve hGRF(l-30)-NH2 aminosav- 20 szekvenciájától, mégpedig a 27. helyen metionin helyett norleucint, a 30. helyen pedig glutamin helyett gamma-amino-vajsavat, illetve gamma-amino-vajsav-amidot tartalmaznak. A korábban idézett közleményekből is- 25 mert, hogy a hGRF( l-30)-NH2 és a hGRFd-301-OH aktivitása mintegy a fele a natív hormonénak, továbbá hogy a natív peptidlánc 27. helyén lévő metioninrész norleucinrészre való cseréjével - amely csere a kémiai szin- 30 tézis szempontjából előnyös, mert a könnyen oxidálódó metionint a szerkezetileg hozzá legközelebb álló aminosavval helyettesítjük - a biológiai aktivitás nem csökken, esetenként kismértékben növekszik. Az általunk elöállí- 35 tott, a 30. helyen gamma-amino-vajsavat, illetve gamma-amino-vajsav-amidot tartalmazó analógok azonban meglepően jó biológiai aktivitást mutattak, ami a 30. helyen végrehajtott aminosav-cserének tudható be. 40 A műszaki leírásban az aminosavak hárombetűs rövidítését a IUPAC-IVB Biochemical Nomenclature (J, Biol. Chem. 247, 977 /1972/) ajánlásai szerint adjuk meg; eltérő utalás hiányában az aminosavak L-konfiguréciójúak. 45 A további rövidítések jelentése a következő: 50 Gaba Boc BHA TFA DIC HOBt HF MPLC 55 HPLC TLC hGRF 60 hpGRF44 65 GH STH release gamma-amino-vajsav maradék terc-butoxi-karbonil-csoport benzhidril-amino-csoport trifluor-ecetsav di-izopropil-karbodiimid 1-hidroxi-benztriazol hidrogén-fluorid középnyomású folyadékkromatográfia nagy teljesítményű folyadékkromatográfia vékonyréteg-kromatográfia humán hipofízis eredetű natív GRF (44 tagú peptid) humán pankreász tumorból izolált GRF, amelynek aminosavösszetétele megegyezik a hipofízis eredetű GRF-ével növekedési hormon növekedési hormon kiválasztás 3
