201509. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fenolszármazékokat hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények és a hatóanyagok előállítására
HU 201509 B 2 5. kísérleti példa 5-Lipoxigenáz gátló hatás Az eljárás: 10* 3 7 RBL-1 sejteket (patkány basofíl leukémia sejtek) 0,5 ml MCM-ben (hízósejt közeg) szuszpendálunk és a kapott szuszpenzióhoz hozzáadjuk 5 a vizsgált vegyületek előzetesen elkészített oldatait (0,5 ml MCM, 50 pg arachidonsav, 10 |ig A-23187 (kalcium-ionofor) és 1 pmól, 0,01 pmól illetve 0,001 pmól végső koncentrációjú fenolszármazék), majd a reakciót 37 °C hőmérsékleten folytatjuk. A reakció befejezése 10 után a reakcióelegyhez hozzáadunk 4 ml etanolt és belső referencia hatóanyagként 1,4-dimetoxi-2-metil-3-(3-metoxi-propil)-naftalint, majd a reakcióelegyet alaposan összerázzuk és 10 percig szobahőmérsékleten hagyjuk állni. A kapott reakcióelegyet centrifugáljuk 15 (2000 ford./perc) 10 percig és a felülúszót elválasztjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A bepárolt anyaghoz 0,5 ml 60 %-os vizes metanolt adunk, a kapott oldatból 100 pl-t nagy teljesítményű folyadékkromatográfiásán vizsgálunk és így meghatározzuk 20 az 5-HETE (5-hidroxi- eikozatetraénsav) mennyiségét. Az 5-HETE meghatározását UV abszorpciós monitoron végezzük a 237 nm-nél mért abszorpcióból. Az 5-HETE termelés gátló hatását (IE) az 25 1 - j x 100 képlettel fejezzük ki, ebben az képletben a a belső referenciával korrigált csúcs magassága vagy csúcs alatti terület a fenol- gg származék nélkül és b a belső referenciával korrigált csúcs magassága illetve a csúcs alatti terület a fenolszármazék jelenlétében. Az eredmények: az eredményeket a 9. táblázat tartalmazza. 9.táblázat A vegyü- Az 5-HETE termelés gátlása (%) let száma A vizsgált vegyületek koncentrációja 10-5 mól 10-6 mól 10~7 mól 57 100 90 27 56 93 93 66 12 96 22 — 6. kísérleti példa Angiogenézis gátló hatás Az eljárás: Héjnélküli korioallantoin membrán vizsgálat A héjnélküli korioallantoin membrán (CAM) vizsgálatot kissé módosított Taylor és Folkman [S. Taylor és J. Folkman: Nature, 297,307 (1982)] szerinti eljárás. 3 napos csirkeembriókat eltávolítunk a héjukból és műanyag edényekben nevelünk, amelyeket műanyag burkolatban függesztünk fel. Az EDGS (endoteliális sejtnövekedést elősegítő anyag. Collaborative Research Inc.) mintákat műanyaglemezekre (polipropilén, 6 mm átmérőjű) helyezzük. Az oldatok megszáradása után a lemezeket 10 napos embriók CAM-jára helyezzük. 3 nap elteltével sztereoszkóppal (X 20, SMZ-10, Nikon) megvizsgáljuk a fumagillin keletkezése alapján a neovaszkuláris gátlást és összehasonlítjuk a kontroli-lemezzel, amely minta nélkül tartalmaz EDGS-t, mint angiogenézis stimulánst. Az eredmények: Az eredményeket a 10. táblázat tartalmazza. 10. táblázat A vegyület Az adagolás A vizsgált A lemezek száma, Kiértékelés száma 0*g) lemezek amelyek angiogenézis száma gátlást mutatnak i 20 6 6 ++ 4 6 3 +++ +: hatásos 100 pg mennyiségnél ++: hatásos 20 pg mennyiségnél +++: hatásos 4 pg mennyiségnél 7. kísérleti példa A vérzési idő meghosszabbítása Az eljárás: A vizsgált vegyületeket orálisan adagoljuk patkányoknak a kísérlet megkezdése előtt egy 55 órával. A patkányokat elaltatjuk és farkukat a farokhegytől számítva 1.5 mm-nél levágjuk. Ezt követően a farkokat 37 °C hőmérsékletű fiziológiai sóoldatba függesztjük fel. Meghatározzuk azt az időt, amely a vérzés kezdetétől a vérzés megszűnéséig telik el 60 (vérzési idő). Az eredmények: Az eredményeket a 11. táblázat mutatja. 11. táblázat A vegyület száma Az adagolás (mg/kg) Vérzési idő (mp) Kontroll (mp) 21 30 529 ± 154** 164 ± 27 10 235 ± 38 173 ± 23 12 30 258 ± 14** 164 ± 27 10 272 ± 52* 173 ± 23 Minden csoport 5 állatból áll. *: p<0,05. **: p<0,01 a kontrollcsoporthoz viszo 65 nyitott megbízhatóság. 25
