201352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil-ecetsav és 4-(2-hidroxi-3- -/izopropil-amino/-propoxi-fenil-ecetsav észterei, valamint 4-(2-hidroxi-3-/izopropil-amino/-propoxi)-fenil-acetamid sztereospecifikus előállítására
7 HU 201352 B 8 dat, 0,2 g/1 koncentrációjú MgS04.7H20 oldat és 10 ml/1 koncentrációjú PS II nyomelem oldat. [A PS II nyomelem oldat összetétele: 0,25 g/1 koncentrációjú (NHUzSOrFeSOröHíO oldat, 0,05 g/1 koncentrációjú ZnS04-7H20 oldat, 0,03 g/1 koncentrációjú MnCh-4H20 oldat, 0,015 g/1 koncentrációjú CuS04-5H20 oldat, 0,015 g/1 koncentrációjú CoCk-6H20 oldat, 0,005 g/1 koncentrációjú H3BO4 oldat, 0,0055 g/1 koncentrációjú Na2Mo04.2Hz0 oldat, 10 0,01 g/1 koncentrációjú KJ oldat és HC1 pH=3 beállításhoz]. . A 15 liter tenyészetet 30 °C-on 24 órán át szaporítottuk. A sejteket kinyertük, és újraszuszpendáltuk 1,5 liter 0,5% glükózt 15 tartalmazó PSX közegben. Ebből 100-100 ml mennyiséget inkubáltunk 2,5% mennyiségű 4- -allil-oxi-fenil-ecetsav-metilészterrel 6 órán át. Ezekből 1 ml-es mintákat extraháltunk meghatározott intervallumonként metilén-klo- 20 riddal, és gázkromatográfiás analízissel (glc) meghatároztuk az S-(+)-4-(2,3-epoxi-prop-Gázkromatográfiás elemzés Az elemzést Varian 3700 típusú készülékkel, (Varian Instrument Group, Walnut Creek Division) 3%-os OVl-t tartalmazó, WHP 100-120 (50 cm x 2 mm) oszlopon (Chrompack, Middelburg, Hollandia) végeztük. AZ analízis körülményei: N2: 30 °C/perc; lángionizációs detektor: 280 °C; injektor: 200 °C. Program: 120-190 °C; 10 °C/perc. A 4-(allil-oxi)-fenil-ecetsav-metilészter retenciós ideje 1,5 perc, a 4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil-ecetsav-metilészter retenciós ideje 3,1 perc volt. A kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze. I. táblázat 4-(allil-oxi)-fenil-ecetsav-metilészter átalakítása S—(+)—4— (2,3-epoxi-propoxi )-f enil-ecetsav-metilészterré Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 alkalmazásával v—metilészter tartalmat. 95 Biomassza g/1 S-(+)-4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil-ecetsav-metilészter mg/g/h (g/1) t = lh t = 3h t = 4h t = 6h 16,3 . 48 (0,8) 78 (3,8) 71 (4,6) 58 (5,6) 14,6 77 (1,1) 94 (4,1) 72 (4,2) 49 (4,3) 15,5 53 (0,8) 69 (3,2) 68 (4,2) 55 (5,1) 2. példa 4~(Allil-oxi)-fenil-ece tsav-metilészter á talakitása S-(+)-4-(2,3-epoxi-propoxi)-fen il-ecetsav-metilészterré Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 alkalmazásával, majd az így kapott vegyület ezt kővető átalakítása S-(-)-4- -[ 2-hidroxi-3- ( izopropil-amino)-propoxi]-fenil-ecetsav-metilészterré 15 liter, ásványi sót tartalmazó, pH=7 értékű, 0,75% glicerint és 0,05% dietoxi-metánt tartalmazó PSX közeget oltottunk be előszaporitott Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 folyadék kultúrával, és inkubáltuk 24 órán át 30 °C-on orbitális rázóberendezésben. A sejteket centrifugálással kinyertük, és 1,5 liter 7,5 pH-ju PSX közegben újraszuszpendáltuk. Ebből 100-100 mól mennyiséget tettünk 2,0 1-es rázólombikba, és inkubáltuk 0,5% glükózzal és 2,5% 4-(allil-oxi)-fenil-ecetsav-metilészterrel 6 órán át 37 °C-on. 6 óra után a sejteket 2,5 1 diklór-metánnal extraháltuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítottuk, és az oldószert elpárologtattuk, és így 42,7 g tömegű, 26% 4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil-ecetsav-metilósztert kaptunk. A nyers izolótumot 550 g szilikagélen 4:6 arányú éter és hexán eleggyel eluálva 40 tisztítottuk, és így 11,04 g S-(+)-4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil-ecetsav-metilésztert kaptunk. [oC]d15 * * * * * * * * * 25 = +8,27° (c=l,39, EtOH). A mérést Optical Activity Ltd. AA 100 polariméterrel végeztük. PMR spekti urna (CDCL3): 45 5=2,72/2,90 (2d, 2H, -CHOCH2), 3,32 (m, 1H, -CHÍCH2), 3,95/4,18 (2d, 2H, OCH2), 6,88/7,2 (2d, 4H, aromás), 3,57 (5, 2H, CH2CO), 3,68 (s, 3H, OCHs). Eu (hfc)3 PMR nem jelzi a jelek szétválását 50 6 2,72/2,90-nél, ami csak egy enantiomer jelenlétét jelzi. E.I. tömegspektrum m/z 222. A PMR analízist Brücker WM készülékkel végeztük. 55 S-(-)-4-[2-Hidroxi-3-(izopropil-amino)-propoxi]-fenil-ecetsav-metilészter szintézise 100 ml vízmentes metanolban oldott 6,0 g (27 mól) S-(+)-4-(2,3-epoxi-propoxi)-fe- 60 nil-ecetsav-metilészterhez hozzáadtunk 37 ml (405 mmól) izopropil-amint. A reakcióelegyet ezután kevertük 24 órán ét 22 °C-on. A feleslegben lévő reagenst és az oldószert bepárlással eltávolítottuk, és az olajos maradé- 65 kot feloldottuk 100 ml diklór-metánban. A 6
